有害赤潮正成为越来越严重的全球性海洋灾害。赤潮微藻传统的分类鉴定主要以形态学特征为基础，需借助显微镜对微藻进行鉴别，因而具有经验丰富的微藻分类学专家才能胜任，因此不利于对大样品量的处理，不能达到快速检测的需要。由于不同种属间基因的多样性，分子生物学技术常被用于赤潮微藻的分类和鉴定。本文以环介导的恒温扩增技术（即LAMP技术）和实时定量PCR技术为研究手段，对几种典型的赤潮微藻的快速检测和定量鉴定开展了研究。同时对目标藻引物设计、筛选、验证开展了研究，并对这些引物进行了实验室验证以及初步模拟现场样品检测。本文的主要研究内容和结果包括以下几个方面：　　 1.赤潮微藻基因组DNA的快速制备研究。　　 本研究以塔玛亚历山大藻(Alexandrium tamarense)、环状异帽藻（Heterocapsa circularisquama）和角毛藻（Chaetoceros sp.）为研究对象，采用超声波法、煮沸法和微波法等3种方法分别对塔玛亚历山大藻（Alexandriumtamarense）、环状异帽藻(Heterocapsa circularisquama)和角毛藻(Chaetoceros sp.)进行细胞破碎及快速制备基因组DNA的研究。通过细胞计数和DNA浓度测定的手段对三种方法进行了比较，以选择适合不同藻种的细胞破碎方法。结果表明，塔玛亚历山大藻和环状异帽藻用超声波法破碎效果较好；角毛藻用微波法较好。用该三种方法制备的基因组DNA做了PCR扩增，电泳检测表明，与CTAB法扩增效果一样。本文建立的微藻DNA快速制备方法有望应用在赤潮藻类的快速分子鉴定方面。　　 2.环介导的恒温扩增技术快速检测几种典型赤潮微藻的研究　　 本研究以链状亚历山大藻(A. catenella)、微小亚历山大藻(A. minutum)、短凯伦藻(K. brevis)和微小原甲藻(P. minimum)为研究对象，首先获得了四种目标藻的ITS序列，然后对得到的序列和相近属种的其他微藻进行比对分析，选取合适的基因片段设计引物，通过筛选，获得最佳引物。每种都以其他8种藻作为阴性对照进行LAMP检测和以外引物F3/B3进行常规PCR扩增和测序，以验证目标藻的引物特异性。同时，对目标藻的基因组DNA进行一系列10倍稀释，进行了敏感度检测并与常规PCR做了对比，得出链状亚历山大藻、微小亚历山大藻、短凯伦藻和微小原甲藻的最低检测限度依次为5.6pg、4.5pg、50pg、3.6pg，敏感度比常规PCR高10-100倍。该方法引入肉眼检测的方法，阳性反应会出现白色混浊，与SYBR Green I反应呈现绿色，该检测方法简便且省去了胶电泳的过程。本研究所建立的LAMP技术特异性好，灵敏度高，稳定性好，重复性好，检测速度快，整个过程在恒温65℃条件下，核苷酸的扩增和检测在1个小时内即可完成，有利于处理大量的样本；不仅可以对高浓度时的微藻样品进行快速检测，也可以对低浓度样品进行检测。　　 3.实时荧光定量PCR方法鉴定和定量检测环状异帽藻和微小原甲藻　　 首先获得了环状异帽藻和微小原甲藻的ITS序列，然后对得到的序列和相近属种的其他微藻进行比对分析，使用Primer Express3.0软件，以目标藻的ITS1区为靶序列设计特异性引物，通过筛选，获得最佳引物，并对引物进行了特异性验证，以其他相近属种的9赤潮微藻为阴性对照，以验证目标藻种的引物特异性。同时，以超声波破碎藻液为模板，进行一系列10倍稀释，进行敏感度检测，环状异帽藻和微小原甲藻的最低检测限度分别为0.5个细胞和0.1个细胞。初步模拟现场样品检测，以含目标藻超声波破碎藻液与其他藻液的混合物为阳性对照的模板，不含目标藻的藻液混合物为阴性对照的模板，得出其他藻的藻液对目标藻的Real-time PCR扩增没有影响。本研究Real-time PCR的标准品采用超声波破碎所得到的破碎藻液，以该标准品所得到的标准曲线，环状异帽藻的标准曲线方程为y=-3.603x+32.598，相关系数为R2=0.989；微小原甲藻的标准曲线方程为V=-3.277x+43.708，相关系数R2=0.993。以上述超声波破碎藻液为标准品定量未知样品，结果显示，Real-time PCR定量结果与镜检结果吻合度很高。本研究所建立的Real-time PCR方法，特异性好，灵敏度高，稳定性好，重复性好，检测速度快，整个过程在2个小时内完成，有利于处理大量的样本。对高浓度和低浓度样本的定量检测都取得了理想的结果。