研究背景:呼吸道合胞病毒(RSV)是引起婴幼儿呼吸道感染最重要的病毒,几乎所有婴幼儿在生后头二年都感染过RSV。RSV下呼吸道感染(RSV-LRTI)是诱发婴幼儿第一次喘息和导致婴幼儿住院最常见的原因,临床观察和研究也发现,婴幼儿急性RSV-LRTI后常发生反应性气道疾病(RAD),在急性期过后的相当长时间内出现反复喘息发作,且目前发现,婴幼儿期RSV-LRTI与哮喘发病密切相关,可明显增加日后慢性持续性哮喘的发生。有关儿童早期RSV-LRTI增加日后慢性持续性哮喘发生的机制尚不明确,推测可能是易感个体在呼吸系统处于快速发育成熟阶段的儿童早期发生RSV-LRTI可启动气道重塑过程,引起气道慢性组织病理学改变,为后续持续性哮喘的发生提供病理生理学基础。Sigurs等对婴儿期患过RSV-LRTI的学龄儿童进行肺通气功能检测发现,该组儿童吸入支气管扩张剂前后的FEV1/FVC和PEF75均明显低于对照组,提示婴儿期RSV-LRTI启动了气道重塑过程,引起气道慢性组织病理学改变。目前关于气道重塑的机理,Holgate等提出了“上皮-间充质营养单位再活化”学说,上皮-间充质营养单位(EMTU)主要由上皮细胞及其下层的间充质细胞(成纤维细胞/肌纤维母细胞)组成,在胎儿肺部生长发育中起重要作用。在正常情况下,肺部发育成熟后气道上皮细胞释放的生物活性分子主要是前列腺素E2(PGE2),PGE2是花生四烯酸经环氧化酶代谢途径产生的代谢产物,可抑制间充质细胞增殖活化,使EMTU处于休眠状态。当哮喘易感个体气道上皮受到吸入环境中有害因素的损伤时,引发异常的损伤-修复过程,上皮细胞发生表型的改变,PGE2的合成减少,而多种生长因子如成纤维细胞生长因子(FGF-2)、胰岛素样生长因子(IGF-1)、血小板衍生生长因子(PDGF)、内皮素-1(ET-1)、转化生长因子-?1(TGF- ?1)、基质金属蛋白酶(MMPs)等持续分泌增加,促使EMTU再活化,上皮下间充质细胞增生转化,平滑肌层增生肥厚,细胞外基质(ECM)合成沉积增多,从而产生气道重塑的过程。由于半胱氨酰白三烯(CysLTs)与PGE2合成共享相同的底物,两者的合成量存在负相关的关系,因此推测,易感个体气道上皮细胞受RSV感染损伤后,CysLTs合成水平上调,抑制了PGE2合成,使EMTU再活化,从而启动了气道重塑的过程。目前有少量动物模型的研究显示RSV感染引起气道重塑,也有研究显示CysLTs在RSV相关喘息和气道重塑过程中起重要作用。本研究为系列研究的组成部分,该系列研究的早期研究结果也发现RSV感染人气道上皮细胞(16-HBE)与上皮下人原代支气管成纤维细胞(HPBFs)复合培养时可上调HPBFs白三烯C4合成酶(LTC4S)表达并促进CysLTs、TGF- ?1和ET-1合成,白三烯调节剂孟鲁司特(Mont)对此过程有明显抑制作用。综上所述,推测RSV感染人气道上皮细胞可能通过上调CysLTs的表达与分泌从而启动气道重塑的过程。但目前缺乏RSV感染人气道上皮细胞对上皮下间充质细胞增生转化和ECM分泌水平影响的研究。另外,要系统研究RSV感染相关喘息的分子生物学机制,必须成功建立RSV感染人气道上皮细胞的体外模型,但目前尚无公认的RSV感染人气道上皮细胞体外模型。目的: 1.通过系列观察RSV不同感染复数(MOI)和不同感染时间感染16-HBE的细胞病变(CPE)改变,探讨RSV感染16-HBE最佳条件以成功建立RSV感染16-HBE的体外模型,为进一步系统探讨RSV感染分子生物学机制提供有效的体外研究细胞模型;2.通过RSV感染人气道上皮细胞与上皮下间充质细胞复合培养模型,观察RSV感染16-HBE对HPBFs向肌纤维母细胞转化及其ECM分泌水平的影响,了解RSV感染气道上皮细胞能否启动气道重塑过程,引起气道慢性组织病理学改变,以期探讨婴幼儿RSV-LRTI引起慢性持续性哮喘的相关机制;3.同时观察常用的哮喘长期控制药物吸入糖皮质激素(布地奈德,BUD)及白三烯调节剂(孟鲁司特,Mont)对RSV感染气道上皮细胞促进上皮下间充质细胞增生转化和ECM分泌过程可能存在的抑制作用,为RSV感染诱发的喘息和儿童哮喘有效早期预防药物的选择提供理论依据。方法:1.细胞培养和RSV传代、冻存、定量:培养实验所需的人喉癌上皮细胞株(HEp-2)、16-HBE和HPBFs。以RSV易感的HEp-2进行病毒的繁殖、传代、冻存,空斑技术测定病毒感染单位量。2. RSV感染16-HBE体外模型的建立:16-HBE细胞以104/ml分种于96孔培养板,50ul/孔待细胞70%汇合后,以MOI分别为0.001、0.01、0.1、1.0和10 RSV接种,动态观察接种24h、48h、72h、96h、120h后16-HBE细胞形态学改变,细胞增殖活性实验检测细胞增殖活性(GI),并以RT-PCR法检测16-HBE细胞中RSV病毒核酸和直接免疫荧光技术察知病毒相应抗原在感染细胞内的定位。3.RSV感染16-HBE对HPBFs向肌纤维母细胞转化的影响:HPBFs以1x105/well接种于放入一小玻片的6孔板,同时16-HBE细胞以大致相同的密度接种于培养小室,以MOI为0.1的RSV接种于16-HBE,吸附2小时将培养小室放入培养有HPBFs的6孔板中。实验分16-HBE-RSV+HPBFs组和16-HBE+HPBFs组,复合培养24h、48h、72h、96h和120h,于各时间点收集6孔板中的HPBFs和上清液,应用间接免疫荧光法(IFA)和蛋白免疫印迹(WB)检测α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达水平,应用竞争性酶连免疫吸附试验(ELISA)检测上清液Ⅰ型胶原(ColⅠ)和纤维结合蛋白(Fn)的分泌水平。4. BUD对RSV感染16-HBE促进HPBFs向肌纤维母细胞转化过程的影响:HPBFs以1x105/well接种于放入一小玻片的6孔板,同时16-HBE细胞以大致相同的密度接种于培养小室,以MOI为0.1的RSV接种于16-HBE,吸附2小时将培养小室放入培养有HPBFs的6孔板中。实验分组:16-HBE+HPBFs组、16-HBE-RSV+HPBFs组、16-HBE-RSV+HPBFs+BUD(10-8mol/L)组、16-HBE-RSV+ HPBFs+BUD (10-6 mol/L)组和16-HBE-RSV+HPBFs+BUD (10-5mol/L)组,复合培养72h后收集6孔板中的上清液和细胞,检测细胞α-SMA的表达水平和上清液中ColⅠ的分泌水平。5. Mont对RSV感染16-HBE促进HPBFs向肌纤维母细胞转化过程的影响:HPBFs以1x105/well接种于放入一小玻片的6孔板,同时16-HBE细胞以大致相同的密度接种于培养小室,以MOI为0.1的RSV接种于16-HBE,吸附2小时将培养小室放入培养有HPBFs的6孔板中。实验分组:16-HBE+HPBFs组、16-HBE-RSV +HPBFs组、16-HBE-RSV+HPBFs+Mont(10-7mol/L)组、16-HBE–RSV+HPBFs+Mont (10-6mol/L)组和16-HBE-RSV+HPBFs +Mont(10-5mol/L)组,复合培养72h后收集6孔板中的上清液和细胞,检测细胞α-SMA的表达水平和上清液中ColⅠ的分泌水平。结果:1. RSV感染16-HBE体外模型的建立:MOI为0.1组接种72h后16-HBE的GI为0.85,即死亡细胞不多,与未感染对照组相比85%细胞仍为活细胞,光学显微镜下观察见细胞胞体增大,透亮度降低,小部分细胞呈坏死聚集状,直接免疫荧光技术能检测到病毒抗原在胞浆内表达,PCR技术能从16-HBE提取的总RNA中扩增出RSV病毒核酸的基因片段,证实RSV成功感染16-HBE,且MOI为0.1和感染时间为72h是RSV感染16-HBE最佳条件。2. RSV感染16-HBE对HPBFs向肌纤维母细胞转化的影响:在24h和48h时,16-HBE-RSV+HPBFs组和16-HBE+HPBFs组未见α-SMA的表达,从72h开始两组均有不同程度的α-SMA表达,96h表达水平最高。16-HBE-RSV+HPBFs组在72h、96h和120h时α-SMA的表达水平均显著高于16-HBE +HPBFs组(t分别为21.883、61.836和4.826,P均<0.05)。在24h、48h、72h、96h和120h时,16-HBE-RSV+HPBFs组ColⅠ的分泌水平均明显高于16-HBE+HPBFs组(t分别为21.692、380.474、32.216、28.812和43.301,P均<0.05),而且随复合培养时间的增加,ColⅠ分泌水平也逐渐增加,120h的分泌水平最高,显著高于24h、48h、72h和96h(t分别为61.776、40.876、54.11和33.845,P均<0.05)。在24h、48h、72h、96h和120h时,16-HBE-RSV+HPBFs组Fn的分泌水平与16-HBE+HPBFs组比较均无统计学差异(t分别为1.058、4.157、1.934、0.467和1.062,P均>0.05),两组各时间段比较也无统计学意义(F分别为0.882和0.366,P均>0.05)。3. BUD对RSV感染16-HBE促进HPBFs向肌纤维母细胞转化的影响: 16-HBE-RSV+HPBFs组α-SMA的表达水平明显高于16-HBE+HPBFs组(t为18.913 , P<0.05)。16-HBE-RSV+HPBFs+BUD(10-8)组、16-HBE-RSV+HPBFs+BUD(10-6)组和16-HBE-RSV+ HPBFs+BUD(10-5)组α-SMA的表达水平与16-HBE-RSV+HPBFs组比较均无统计学意义差异(t分别为0.401、0.564和0.72,P均>0.05)。16-HBE-RSV+HPBFs组ColⅠ的分泌水平明显高于16-HBE+HPBFs组(t为35.694,P<0.05)。16-HBE-RSV+HPBFs+BUD (10-8)组、16-HBE-RSV+HPBFs+BUD(10-6)组和16-HBE-RSV+HPBFs+BUD(10-5)组ColⅠ的分泌水平与16-HBE-RSV+HPBFs组之间比较均无统计学意义差异(t分别为2.365、3.594和4.061,P均>0.05)。4. Mont对RSV感染16-HBE促进HPBFs向肌纤维母细胞转化的影响: 16-HBE-RSV+HPBFs组α-SMA的表达水平明显高于16HBE+HPBFs组(t为36.957,P<0.05)。16-HBE-RSV+HPBFs+Mont (10-7)组、16-HBE-RSV+HPBFs+Mont(10-6)组和16-HBE-RSV+HPBFs+Mont(10-5)组α-SMA的表达水平明显低于16-HBE-RSV+ HPBFs组(t分别为22.583、63.316和159.96,P均<0.05)。16-HBE-RSV+HPBFs组ColⅠ的分泌水平明显高于16-HBE+HPBFs组(t为101.817,P<0.05)。16-HBE-RSV+HPBFs+Mont(10-7)组、16-HBE-RSV+HPBFs+Mont(10-6)组和16-HBE-RSV+HPBFs+Mont(10-5)组ColⅠ的分泌水平明显低于16-HBE-RSV+HPBFs组(t分别为12.846、26.522和28.418,P均<0.05)。结论:1.RSV可成功感染16-HBE,但受RSV感染的16-HBE仅出现细胞胞体增大,透亮度降低,坏死细胞增多呈聚集状,不形成典型融合病变,MOI为0.1和感染时间为72h是RSV感染16-HBE最佳条件;2.RSV感染人气道上皮细胞与上皮下成纤维细胞复合培养时可以促进成纤维细胞向肌纤维母细胞转化并促进细胞外基质ColⅠ的分泌,从而启动气道重塑的过程。3.白三烯调节剂孟鲁司特能有效抑制RSV感染人气道上皮细胞促进成纤维细胞向肌纤维母细胞转化并增加细胞外基质ColⅠ分泌的过程,提示CysLTs在RSV相关喘息及其启动气道重塑中起重要作用。4.吸入糖皮质激素BUD不能有效抑制RSV感染人气道上皮细胞促进成纤维细胞向肌纤维母细胞转化并增加细胞外基质ColⅠ分泌的过程,这可能是糖皮质激素对婴幼儿RSV感染相关喘息疗效不明确的原因。5、RSV感染诱导气道上皮细胞分泌CysLTs,从而启动气道重塑过程可能是导致易感个体RSV-LRTI后反复喘息与持续性哮喘发生的分子生物学途径之一,对RSV相关喘息及其启动气道重塑分子生物学机制的阐明,可望为儿童哮喘早期有效预防药物的选择提供理论依据,可望能在婴幼儿RSV感染急性期即给予有效的防治药物,以阻断RAD及日后持续性哮喘的发生。