番茄SYTA的功能及其与Fd I互作研究

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番茄(Solanumlycopersicum)作为茄科典型的代表植物,在农业生产中占有重要的地位。番茄在生长发育过程中,会经常受到干旱、盐、高温、低温等非生物胁迫以及病毒真菌等生物胁迫的影响,造成植物的损伤,进而严重限制了番茄的正常生长发育和作物产量。Synaptotagmin是一种膜转运蛋白,广泛存在于内分泌及神经细胞上。它是囊泡融合中的Ca2+感受器,能够触发调节囊泡与质膜之间的融合过程,在蛋白质及膜转运过程扮演着重要的作用。前期研究仅有关于拟南芥SYTA在植物抗病方面的相关研究报道。  本文通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测番茄各个部位S.lSYTA的表达量以及其在响应非生物胁迫及生物胁迫下的表达量变化,初步探究S.lSYTA的生物学功能,结果显示S.lSYTA在根中的表达最高,其次是叶,在茎中的表达量最低。当冷胁迫12h后能诱导S.lSYTA的大量表达,并且随着时间的推移逐渐增加。而在热激的最初3h内表达量明显受到抑制,虽然在12h恢复到正常水平但之后又会下降。在经过盐胁迫处理后,S.lSYTA的表达量在3h之内没有明显的变化,但在12h之后会有所下降。用绿色荧光蛋白(greenfluorescenceprotein,GFP)标记的烟草花叶病毒(Tobaccomosaicvirus,TMV)侵染番茄导致其S.lSYTA表达量在接种后第1天显著上调,在第7天下降至正常水平。为探究S.lSYTA对植物病毒侵染移动的影响,构建植物瞬时表达载体pCV-S.lSYTA-mGFP,并通过农杆菌介导在本氏烟草中瞬时表达,在TMV-GFP攻毒下,利用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测在本氏烟中瞬时表达S.lSYTA时TMV-GFP的积累和移动情况,结果显示在S.lSYTA瞬时表达的本氏烟叶片部位接种TMV-GFP,TMV-GFP在接种第5天时已经到达新叶,而接种部位仅表达空载体对照的本氏烟新叶中未观察到TMV-GFP,且接种第5天时TMV-GFP在接种叶和新叶中的积累量均明显高于其在空载体对照处理的叶片。  为了全面解析S.lSYTA生物学功能,用农杆菌介导的叶盘转化法获得7株S.lSYTA基因过表达转基因本氏烟,并利用qRT-PCR和免疫印迹试验(WesternBlot)验证转基因烟草中S.lSYTA的表达量,发现S.lSYTA转基因本氏烟中S.lSYTA的表达均得到过表达,且FdI的表达量下降,DCL的表达量升高。通过转录组测序技术(RNA-Seq)对S.lSYTA转基因本氏烟T0进行分析,结果显示DEGs中有4160个基因表达量发生变化,其中上调表达基因有1603个,下调表达基因2557个,并且qRT-PCR结果显示,在S.lSYTA转基因本氏烟中TMV抗性基因N的同源基因相对表达水平显著低于野生型,PERK3受体蛋白相关基因的相对表达水平显著高于野生型。利用qRT-PCR检测在TMV胁迫的S.lSYTA转基因本氏烟中TMV-GFP的移动变化,结果显示S.lSYTA转基因本氏烟在TMV-GFP攻毒的72h后,TMV-GFP已移动到新叶上,而仅野生型的新叶中没有观察到TMV-GFP,TMV的移动速度有明显的增快。  为明确S.lSYTA在植物病毒侵染致病过程中的作用,利用酵母双杂交(Yeasttwohybrid,Y2H)及双分子荧光互补(Bimolecularfluorescencecomplementation,BiFC)验证S.lSYTA与FdⅠ蛋白互作关系,结果显示,共转化S.lSYTA与FdⅠ的酵母菌株能够在营养缺陷型培养基上正常生长并能够在X-α-gal存在的情况下使菌落变蓝,且共聚焦显微镜下观察到黄色荧光蛋白,互作区域主要集中在FdⅠC端的96-130个氨基酸之间。  综上表明S.lSYTA是一个胁迫诱导表达基因,在番茄生长发育和应答胁迫过程中具有重要作用。S.lSYTA基因过量表达的转基因植物通过调控抗逆相关基因的表达,降低了转基因植株的抗病能力。S.lSYTA通过CPTMV-FdⅠ-S.lSYTA-MPTMV这条蛋白互作链,促进植物病毒在植物细胞间的运动。
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