本研究以课题组发现的来源于土壤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)Ag39的新型固氮酶基因nifT44为基础，从另外两株自生固氮菌中克隆到该基因并构建其原核表达体系，初步探讨了nifT44基因编码的固氮酶不同于传统固氮酶的特性。首次获得可在空气中表达固氮活性的细胞体外固氮酶，研究结果如下：　　 1、目标固氮菌株筛选及nifT44基因原核表达　　 从本研究室固氮菌库中选取32株菌株，通过固氮酶活性测定和nifT44基因扩增，筛选到两株自生固氮菌：阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)Y3208和荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)XS442。构建不同菌株来源的nifT44基因的原核表达体系，阳性重组子命名为nifT44-EC和nifT44-PF。用LB选择培养基，先在37℃将重组子培养至OD600为0.4-0.6，加入终浓度为0.4mmol/L的IPTG，转为28℃，诱导培养5h，可使目的蛋白最优化表达。　　 2、nifT44固氮酶活性的测定　　 采用纳氏试剂分光光度法和15N同位素示踪法测定nifT44基因表达后离体固氮酶的活性，结果表明：纳氏试剂分光光度法测得重组子nifT44-EC和nifT44-PF粗酶的氨氮含量分别为52.81mg/L和50.75mg/L，纯酶的氨氮含量分别为32.84mg/L和34.32mg/L。15N同位素示踪法测得nifT44-EC粗酶的15N丰度比宿主菌E.coli BL21(DE3)粗酶的15N丰度提高183％，比天然丰度提高365%;nifT44-EC和nifT44-PF纯酶的15N丰度分别比天然丰度提高67.2%和9.56%，充分证明该酶可催化固氮。　　 3、nifT44固氮酶特性的初步研究　　 采用纳氏试剂分光光度法和铵离子浓度法初步研究了nifT44固氮酶的特性，结果表明：该酶对氧和铵不敏感，可在空气中固氮，反应体系中添加2mmol/L的NH4+时该酶仍能保持部分活性。反应温度范围20℃-45℃，pH范围4.0-9.0均可固氮，在35℃，pH7.0±0.5条件下反应30h活性最高。金属离子(10mmol/L)中，Mg2+可提高nifT44固氮酶活性，Ni2+、Zn2+、Mn2+和Ca2+可部分抑制酶活，K+、Mo6+、Fe3+和Cu2+对酶活无显著影响。化学试剂中，终浓度为10mmol/L的Mg2++ADP和Mg2++ATP可依次提高nifT44固氮酶活性，2%(V/V)的NP-40、TritonX-100、DMSO和Tween-20可部分抑制酶活，SDS(2%，m/V)和EDTA(10mmol/L)可完全抑制酶活。气体成分中，N2+H2+O3(1：1：1)及N2+H2+O2(1:1：1)可提高nifT44固氮酶活性，N2可抑制酶活，N2+H2(3:1)对酶活无显著影响。　　 新型固氮酶基因nifT44编码表达的固氮酶克服了传统固氮酶对氧气敏感、不耐铵、易失活、不便研究的缺陷，实现了生物固氮研究领域的一项突破，具有重要的理论意义与应用价值。