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高危型人乳头瘤病毒(High-risk Humanpapillomavirus,HR-HPVs)的感染(如HPV16)是细胞发生恶性转变的必要条件,E6和E7是其主要的致癌基因。HPV16可通过表观遗传学路径导致肿瘤的发生,其中研究最多的是DNA甲基化。我们设想HPV16E6/E7可以通过DNA甲基化修饰导致细胞的恶性转化。本研究将HPV16 E6/E7通过慢病毒感染的方式转入原代人包皮角质形成细胞(Human Foreskin Keratinocytes,HFKs)构建永生化细胞系并进行鉴定;观察将HPV16E6/E7转入原代细胞及分别沉默肿瘤细胞中HPV16E6或E7后,DNMTs的表达情况,目的基因的甲基化水平及表达情况;最后,将永生化细胞及宫颈癌细胞(SiHa、CaSki)进行全基因组DNA序列、全基因组RNA及DNA甲基化测序,通过数据分析,筛选并发现在细胞永生化及肿瘤细胞形成过程中发挥不同功能的目的基因,为进一步研究基因的功能奠定基础。第一部分永生化角质形成细胞的构建与鉴定目的:将HPV16E6/E7转入原代HFKs,构建永生化细胞,并对永生化HFKs进行鉴定。方法:(1)使用两步消化法及体外无血清培养基培养法分离及培养原代HFKs,观察原代HFKs的生长特性;(2)构建慢病毒质粒LV5-HPV16E6/E7,并经测序验证序列正确后,将质粒包装成高滴度慢病毒;(3)慢病毒感染传代2次的原代HFKs,嘌呤霉素筛选2周,持续培养;(4)通过实时荧光定量核酸扩增(QuantitativePCR,qPCR)及Western Blot检测永生化细胞中HPV16 E6和E7的mRNA及蛋白表达情况,CCK-8检测细胞永生化过程中细胞增殖水平的改变,Transwell实验检测永生化细胞的侵袭能力,裸鼠致瘤实验观察永生化细胞能否导致肿瘤发生。结果:(1)成功分离原代HFKs,并可在体外连续传代。连续传代10次左右原代HFKs出现衰老表现,逐渐死亡。(2)成功构建LV5-HPV16E6/E7重组质粒,并将其包装成滴度为1×109TU/mL的慢病毒。(3)将HPV16E6/E7转入原代HFKs后,可连续传代30次以上,符合永生化细胞的定义。(4)永生化细胞中HPV16 E6和E7的mRNA、蛋白表达水平明显升高;随着传代次数的增加,细胞增殖水平逐渐升高;Transwell实验表明永生化细胞不能通过Matrigel基底膜,不具有侵袭能力;将永生化细胞注射至裸鼠皮下不会形成肿瘤,永生化细胞不具有致瘤能力。结论:LV5-HPV16E6/E7慢病毒感染原代HFKs后,HPV16E6和E7可在细胞中稳定表达,并使得细胞发生永生化。永生化细胞可连续传代30次以上,但不具有肿瘤细胞的侵袭能力及致瘤能力。第二部分HPV16 E6/E7对DNA甲基化的影响目的:观察HPV16E6和E7对DNMTs表达水平及目的基因甲基化、表达水平的影响,证明HPV16 E6和E7可通过甲基化途径影响目的基因的表达。方法:(1)qPCR及Western Blot法检测慢病毒感染前HFKs(Blank)、不同代数 HPV16E6/E7HFKs(A1、A10、A20、A30)及 SiHa(阳性对照)中 4 种 DNMTs的mRNA、蛋白表达水平;(2)亚硫酸氢钠处理后测序技术检测不同组细胞中6种目的基因启动子区的甲基化水平,qPCR及Western Blot法检测不同组细胞中6种目的基因的mRNA、蛋白表达水平;(3)qPCR检测分别沉默HPV16E6或E7后不同时间点(0、24h、48h、72h、96h)4 种 DNMTs 的 mRNA 表达水平;(4)MS-HRM检测分别沉默HPV16 E6或E7后的不同时间点6种目的基因启动子区的甲基化水平,qPCR检测分别沉默HPV16 E6或E7后的不同时间点6种目的基因的mRNA表达水平。结果:(1)将HPV16E6/E7转入HFKs后,4种DNMTs的mRNA及蛋白表达水平均发生不同程度升高;而分别沉默肿瘤细胞中的HPV16 E6或E7后,4种DNMTs的mRNA表达均发生不同程度下降。(2)将HPV16E6/E7转入HFKs后,MT1G、RRAD、TFPI2启动子区甲基化水平明显升高,mRNA及蛋白表达水平下降,SPARC、SFRP1、NMES1启动子区的甲基化水平及mRNA、蛋白表达水平变化不明显;而分别沉默肿瘤细胞中的HPV16E6或E7后,6种目的基因启动子区的甲基化水平均明显下降,mRNA表达水平均显著升高。结论:HPV16E6/E7可通过影响DNMTs的表达,调控目的基因启动子区的甲基化,进而影响其表达,参与细胞的恶性转化。第三部分永生化及肿瘤细胞的全基因组DNA、RNA及甲基化测序目的:全面观察永生化过程中全基因组DNA序列、全基因组RNA及DNA甲基化变化情况,及永生化细胞与肿瘤细胞在以上方面的差异,筛选并发现在细胞永生化及最终肿瘤细胞形成过程中发挥不同功能的通路及目的基因,为进一步研究基因的功能奠定基础。方法:对Blank,A1、A15、A30,SiHa、CaSki进行全基因组DNA测序、甲基化测序、转录组测序。结果:(1)在细胞永生化过程中,非同义突变较少,DNA变异程度低;HPV16 E6/E7 HFKs与肿瘤细胞间有300多个非同义突变,DNA变异程度高。(2)在细胞发生永生化的过程中,随着传代次数的增加,其与肿瘤细胞之间甲基化差异呈缩小趋势。但传至30代时,永生化细胞与肿瘤细胞之间依旧存在较大差异。(3)筛选出细胞永生化过程中甲基化差异明显的基因及富集通路。(4)筛选出永生化细胞与肿瘤细胞间甲基化差异明显的基因及富集通路。结论:随着传代次数的增加,HPV16E6/E7HFKs与肿瘤细胞之间的甲基化差异呈缩小趋势,传至30代时,两者之间依旧存在较大差异。在细胞永生化过程中,DNA甲基化可能是一个连续且逐步发展的过程。筛选在细胞永生化及恶性转变过程中通过DNA甲基化修饰发挥关键作用的基因及通路。在细胞永生化过程中,未发现有意义的DNA突变,HPV16 E6/E7引起的DNA甲基化可能发挥了关键作用。在细胞癌变的过程中,DNA突变及甲基化可能都发挥了不可或缺的作用。