MicroRNAs对家蚕丝蛋白轻链的调控及家蚕14-3-3ξ基因互斥外显子选择机制研究

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MicroRNA是一类内源性小分子单链RNA,长度通常为21-22个核苷酸,通常能够通过与靶基因mRNA的3端非编码区(3UTR)发生碱基配对,引起靶基因mRNA的降解或者抑制其翻译,从而起到基因转录后的表达调控作用。MicroRNA通过对其靶基因的调控而发挥功能,所以鉴定其靶基因,对于研究microRNA的生物学功能来说至关重要。   家蚕丝蛋白是一种不溶解性的白色蛋白质,作为原料丝的基本组成部分,具有重要的经济价值。而其中的丝素轻链蛋白又是极其重要的组成部分。之前有研究者通过异源体系鉴定到丝素轻链蛋白可能受到mieroRNA的调控,但是,异源体系鉴定有其局限性,因为植物microRNA与动物microRNA作用途径方式有较大区别,所以我们以家蚕BmN细胞为研究载体,利用绿色荧光蛋白报告基因系统发现miR-190可能对丝蛋白轻链基因起调控作用。对microRNA进行组织特异性表达分析时发现,miR-190相较于其他组织,在后部丝腺中表达量较多,这从另一方面也预示着miR-190极有可能调控着丝轻链蛋白的表达。   为了更好的从蛋白水平研究microRNA对丝蛋白轻链的调控,我们原核表达了丝素轻链蛋白,并且利用此蛋白免疫新西兰兔子,通过ELISA检测及Western印迹检测,都证实了我们得到了效价极高的抗丝素轻链蛋白抗体血清,这也为进一步研究microRNA对丝蛋白的调控打下了扎实的基础。   互斥剪接是选择性剪接的其中一种,后者是基因转录后加工的一个重要调控步骤。互斥剪接包括互斥基因剪接以及互斥外显子剪接,研究的较多的是互斥外显子剪接,也即从一个外显子簇中只选择其中一个外显子进入成熟的mRNA中,从而使得生物体产生蛋白多样性。互斥剪接约占全部剪接事件的10%左右,对其的剪接机制,许多研究者也对此进行了研究探讨,并提出了一些模型予以解释。   14-3-3ζ基因是14-3-3基因家族中的一员,后者广泛存在于真核生物中,是一类重要的调控因子,它能结合多种信号转导相关蛋白,从而起调控作用。本实验从实验室已有的果蝇14-3-3ζ基因研究成果出发,发现了家蚕14-3-3(基因含有一对互斥外显子5a、5b,通过对家蚕在内的八种鳞翅目物种此基因序列分析,发现了两段高度保守的选择序列(SS)和停泊序列(AS),且它们之间能形成很好的RNA配对二级结构。通过构建野生型mini-gene载体以及一系列的缺失和突变载体,进行实验,表明了此二级结构对5a,5b的互斥表达起到了重要的调控作用,如果这区域的序列能形成良好的二级匹配结构,则5b外显子的表达受抑制,而5a外显子的表达则被激活。反之,则5b外显子的表达被激活。当我们将mini-gene中的外显子5a进行去除时,情况亦然。鉴于此,我们提出了调控家蚕14-3-3ζ基因互斥外显子的机制模型,这也进一步丰富了互斥外显子选择机制的研究。
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