猪胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,App)可引起猪的急性出血及慢性纤维素性胸膜肺炎为特征的高度传染性呼吸系统疾病,具有较高的发病率及死亡率,呈世界范围流行,严重影响着养猪业的发展。该菌在耐药机制与抗原性方面的进化,导致了抗生素疗效差及疫苗免疫保护率低等难题。科学制定防控措施需基于对病原致病机制的掌握,使有效切断传播途径及控制感染成为可能。随着高通量测序技术的发展,基因研究进入大数据时代及后基因组时代,加速了系统机制研究的进程。本研究采用高通量测序技术(RNA-seq)对App7型菌株感染小鼠肺组织进行转录组测序研究,有利于揭示病原与宿主的免疫互作机制。1.App小鼠感染模型的建立选取SPF昆明鼠(Mus musculus,Mmu)成功构建App腹腔注射及滴鼻感染模型,采用基于16SrDNA基因建立的荧光定量PCR方法对两种感染模型中不同时间段各器官组织菌含量进行了检测,并同时进行HE染色分析其病理组织变化。结果显示,两种感染模型中小鼠死亡情况、组织菌含量等具有剂量依赖性及感染时序性,但滴鼻感染组组间差异较大。各器官均有检出,表明该菌在小鼠体内实现了增殖并向其他组织扩散,具有侵染性;其中,腹腔注射组小鼠脾脏及肝脏菌含量高于肺组织,心脏含量最低;滴鼻组小鼠肺组织菌含量最高,且组织病变最严重。对滴鼻感染模型进行优化,结果表明,当攻毒剂量为10倍腹腔注射LD50(4.26×109cfu),此时小鼠肺组织含菌量高、临床症状及病理变化典型,为后续肺组织转录组测序的开展奠定了基础。2.App感染小鼠免疫互作转录组分析将感染App 8 h后的5份菌含量最高的小鼠肺组织RNA样品进行等量混合,采用IlluminaHiseq2500 RNA-seq测序技术进行转录组测序,设体外培养菌体及PBS处理组小鼠肺组织为对照组,构建4个cDNA文库:感染肺组织中App cDNA文库(T01)、体外培养菌体cDNA文库(T02)、感染肺组织cDNA文库(T03)及健康肺组织cDNA文库(T04),与对应参考基因组的比对率分别为15.68%、97.99%、67.68%及 85.01%。筛选 App 差异表达基因(T01_vs__T02)333 个,其中上调113个,下调220个;感染小鼠肺组织差异表达基因(T03_vs_T04)2,428个,其中上调1,484个,下调944个。此外,从真核组与原核组各选8个显著差异表达基因进行qPCR检测以验证测序的准确性,结果显示qPCR测得结果与RNA-seq测序结果的相关性系数为0.989,表明二者具有较强的相关性。对App差异表达基因进行功能注释及表达量分析,结果显示,大量代谢相关基因出现高表达,主要为无氧代谢相关基因,如adhE、sdaC、dmsA,B,C,D、torY,Z等,编码氧化还原酶和氢化酶,参与细菌的无氧呼吸代谢活动。另一方面,主要毒力基因表达下调或差异表达不显著,其中,apxIA,D、ompA、tbpA,B、metQ1,2等均表达下调。此外,部分毒力基因上调表达,其中,murC,G、lrgB、glmS及alr等参与细菌细胞壁及细胞膜的形成,UreB,C编码尿素酶,参与App的免疫逃逸作用。对小鼠差异表达基因在免疫信号通路上的富集分析,结果显示,大量免疫信号通路被激活,主要包括NLR信号通路、TLR信号通路、RLR信号通路、胞内DNA识别信号通路、TNF信号通路、BCR信号通路、TCR信号通路、NF-kB信号通路、Jak-STAT信号通路、MAPK信号通路等,造成细胞因子多种类、大规模的释放,包括、Csf2、Cxc12、Cxc110、Cxc13、IL-6、IL-1β、IL-23a、IL-1α、IL-10、IL-36y、IL-17F、IL-17A、Cc14、Cc13、Cc120、Cc12、Cc17、TNF 及 IFNy等,一些细胞因子对信号通路的正反馈作用进一步促进了其表达,造成细胞因子瀑布级联。其中多数细胞因子参与了 IL-17/IL-23调控网络,表明其在机体抗App感染中发挥着重要作用。