携带hTRAIL的复制型溶瘤腺病毒治疗恶性肿瘤的研究

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恶性肿瘤严重危害人类生命健康,目前它已经超过心脑血管疾病而跃居为人类致死疾病的首位。全世界每年死于恶性肿瘤的人数超过700万,仅在我国每年新发肿瘤病人达200余万,死亡约160万人。对于大多数种类的肿瘤,仍在沿用传统疗法如手术、放疗、化疗等进行治疗,然而面对很多中晚期恶性肿瘤,传统疗法显得束手无策。而基因治疗方案至今在临床治疗中仍然没有实质上的突破。 最近有研究报道了一种有复制能力的溶瘤腺病毒ONYX015联合化疗试剂治疗复发的头颈癌致使63%的肿瘤消退,而且这种溶瘤病毒曾经进入临床Ⅲ期研究。然而当ONYX015单独使用仅仅使肿瘤消退15%,我们认为造成ONYX015低效的主要原因之一在于它缺少克隆位点以便于外源抗癌基因的插入。为了克服这种缺陷,我们构建了一种类似于ONYX015并且含有一个Bgl Ⅱ克隆位点的溶瘤腺病毒载体ZD55,在此基础上插入肿瘤凋亡基因hTRAIL表达框形成基因—病毒ZD55-hTRAIL,而且从两方面对这种基因—病毒进行了深入研究。 通过Bgl Ⅱ位点,hTRAIL基因被插入到ZD55中形成ZD55-hTRAIL,这种插入了外源抗癌基因的有复制能力的腺病毒我们称之为靶向基因—病毒。SW620,HCT116和HT29三种结肠癌细胞对ZD55-hTRAIL都敏感,而尤其对ZD55-hTRAIL联合5-FU敏感。ZD55-hTRAIL联合化疗药物5-FU治疗SW620人结肠癌产生明显的协同或者增强效应。在SW620裸鼠移植瘤模型实验中,不同处理组在11周的平均肿瘤体积分别为(PBs>2700 mm3,5一Fu>1300 mm3,o盯xois为1051.3 mm3,zD55~hTRAIL为600.05 mm3和功55一hT凡虹L+5一刊为230.2 mm3),在14周只有联合治疗组的小鼠全部存活而且其中有一只裸鼠肿瘤完全消退。通过住M分析,溶瘤病毒处理的肿瘤细胞由于病毒复制和增殖而导致裂解。RI’- PCR和免疫组化分析说明TRAIL仅仅在ZD55一hTRAIL处理的肿瘤细胞内表达。而且,通过对AST和ALT等分析没有检测到肝毒性。据我们所知,这是TRAIL在靶向基因一病毒治疗中及其联合5.FU化疗中的首次应用,这种治疗策略可能在肿瘤临床治疗上有着潜在应用价值。 尽管ZD55一hTRAIL无论在体内还是体外的溶瘤效率都比单独的病毒治疗 (ZD55或ONYX015)高,但仍然不能完全消除所有的肿瘤。为此我们进一步提出靶向双基因一病毒治疗策略,并以hTRAIL和k5基因进行双基因一病毒为例进行治疗实验研究。首先我们采用非增殖型腺病毒Ad.G即同增殖溶瘤腺病毒ZD55一luc联合处理正常细胞NHLF和肿瘤细胞SW620时,结果发现在120hr后GFP在Sw620中的表达量显著增加,由此我们推断增殖溶瘤腺病毒ZD55七TRAIL能够支持非复制型腺病毒的增殖从而增加非复制型腺病毒介导的外源抗癌基因在肿瘤细胞内的表达量。在随后动物实验的研究结果也表明ZD55一hTRAIL和Ad一k5联合的双基因一病毒治疗组的肿瘤体积在施药后不久迅速下降,在第30天时移植瘤完全消失,ZD55一hTRAIL组次之,而Ad一k5组较差。我们进一步研究ZD55一hTRAIL和Ad一k5联合的靶向双基因一病毒治疗的机制。对于hT凡虹L,体外的FACS试验和体内的TUNEL实验已经证实TRAIL能够增强肿瘤凋亡诱导作用;而对于k5,在体外试验中显示Ad一k5能对人脐静脉内皮细胞特异性的抑制,而对其他来源的正常细胞及肿瘤细胞几乎没有作用,CD31免疫组化证实k5能有效的抑制肿瘤组织中新生血管生成作用。Rl、PCR实验证实了在双基因一病毒治疗组的肿瘤组织中有k5和hTRAIL的mRNA表达,而在ZD55一hTRAIL基因一病毒治疗组中仅有hTRAIL的mRNA表达和Ad一ks治疗组也只有ks mRNA的表达。因此,TRAIL能通过细胞外死亡受体途径诱导转化或癌变的肿瘤细胞凋亡,而对正常细胞不起作用;K5是血纤维蛋白溶酶原的第五个玲ingle,它比血管抑素具有更强的心血管生长抑制作用。这里双基因通过不同的机制发挥互补或者协同效应杀伤肿瘤,并且随着溶瘤腺病毒在肿瘤组织中的传播二者的表达水平大大提高。在这个策略中,我们认为一个基因难以消灭所有的肿瘤,而三个或更多的基因是似乎显得繁琐,因此,靶向双基因一病毒治疗策略应该是在癌症治疗中不联合化疗而能杀伤所有肿瘤的最好的治疗方案之一。 同时,我们也探讨TRAIL高效表达和分泌的方法,以提高其对肿瘤凋亡诱导的能力。本文采用二次PCR的方法构建一种分泌型TRAIL重组真核表达载体PcDNA一scsF一tTRAIL,也构建了另一种非分泌型对照载体peDNA~TRAIL。PcR和酶切鉴定证实前者含有编码30 aaG一CSF信号肤和187 aa tTRAIL的融合蛋白基因。通过EUSA测定重组载体转染COS7.O细胞上清中TR虹L相对表达量发现分泌型TRAIL重组载体表达T凡虹L水平在48 hr时达到最高量,而非分泌型T凡牡L重组载体在第三天才略有提高。当我们用分泌型TRAIL载体转染COS7.0细胞48hr时获得的上清处理三种结直肠癌细胞系(S w6加,HCTn6和劫Vo)和一种正常成纤维细胞(NHLF)时发现,助Vo对这种上清最为敏感,而NHLF几乎没有应答,同时我们也发现劫Vo细胞没有死亡受体转录表达。根据上述实验结果我们得出G一CSF信号肤+截短的TRAIL形成的融合蛋白用于肿瘤基因治疗是可行的,而且在此基础上将TRAIL融合?
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