传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus，IBDV)主要侵害3-5周龄雏鸡的体液免疫中枢器官-法氏囊的前B淋巴细胞，引起感染鸡的发病死亡和免疫抑制，并增加了对其他病原的敏感性。目前对于宿主响应IBDV感染的分子机制，尤其是IBDV感染后胞内泛素-蛋白酶体通路(ubiquitin proteasome pathway，UPP)的变化机制知之甚少。本研究以CEF-16细胞适应毒感染DF-1细胞为模型，鉴定了病毒编码蛋白与UPP的共定位并分析了它们的相互作用，并从基因转录、蛋白翻译、生物学活性等不同角度研究了IBDV感染对宿主细胞UPP的影响，为更好地理解IBDV感染机制与宿主细胞的抗病毒策略提供了新线索。　　 1.IBDV编码蛋白与UPP相互作用分析制备了兔抗UPP相关蛋白E1、UBC9、CHIP、UCHL1、UCHL5、HIP2、Casp3、Casp8、Casp9、p65、p105、IκB、MHCⅠ和MHCⅡ的多克隆抗体，通过建立双免疫荧光标记技术，分析了IBDV感染细胞中的5种病毒蛋白与UPP中各种重要组分的定位关系。结果显示，在IBDV感染细胞内，泛素蛋白或泛素化的蛋白经MG132处理后被检测到在细胞质中呈散点状分布；IBDV的5种病毒蛋白中，只有VP3蛋白与泛素蛋白以及一种E2蛋白UBC9在细胞中呈现共定位现象。同时采用免疫共沉淀的方法验证了上述蛋白之间的相互作用。另外，VP3真核表达载体转染细胞中上述蛋白之间也存在共定位关系，进一步确定了宿主UPP利用UBC9对病毒VP3蛋白的靶向选择作用。　　 2.IBDV感染对宿主UPP相关组分转录本的调节 IBDV感染DF-1后，应用荧光定量RT-PCR技术分析感染后宿主UPP中27个相关基因转录本的变化。分析显示，IBDV感染引起了UB、UBI、E1、UBC9、UCHL5、PSMA2、PSMB7、PSMC1、PSMC5、PSMD2、PSMD5、PSME3和PSMF1十三个基因的上调，同时CHIP、HIP2、UCHL1和PSME4四个基因的下调，PSMA6和PSMB1在病毒感染前后没有显著变化；与UPP相关的介导细胞凋亡的信号通路NF-κB和caspase通路中p65、p105、IκB、Casp3、Casp8和Casp9六个关键基因以及MHC抗原递呈途径中MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ两个组分都在病毒感染后不同时间点被上调。随后，比较研究表明DF-1传代细胞和CEF原代细胞在响应病毒感染过程中的转录本变化趋势基本保持一致。采用不同毒力的IBDV进行比较感染可知，强毒和弱毒IBDV感染引起的UPP转录本的变化趋势基本一致，只是在不同时间点调控的幅度略有不同，说明进化上相关的病毒诱导了同一种特异的宿主UPP的响应模式。进一步利用病毒体内感染的靶器官也揭示了一种比体外模型上变化更加温和的响应模式，即一些在体外模型上变化显著的基因如E1、UBC9、PSMB7，PSMC5，PSME3等基因，在体内反而没有发生显著变化。另外，通过将表达VP1、VP2、VP3、VP4和VP5的真核表达载体转染DF-1细胞并研究UPP转录本的变化，揭示了IBDV感染对宿主DF-1细胞中UPP转录本的调控虽然并不是由于某一个基因单独引起的，但是VP3可能在其中起着关键的介导作用。　　 3.IBDV感染对宿主UPP相关组分蛋白水平的调节通过制备的全套抗UPP蛋白的兔多抗，对IBDV感染细胞中UPP各蛋白的表达变化进行了检测，结果发现，UPP中的E1、UBC9及CHIP在病毒感染后的表达量均有所增加；去泛素化酶UCHL1在感染后至24h表达量最大，此后表达量有所下降，72h基本不表达，96h和120h又恢复表达；UCHL5在感染末期才表达；Caspase途径和MHC途径中的主要组分的表达量均出现增加，多数在感染末期120h达到最大表达量。NF-κB途径中组分在感染前期上调，48h之后基本不表达。同时利用以上多抗对IBDV感染细胞中UPP三种酶蛋白进行了亚细胞定位，结果发现病毒感染引起了E1和UBC9点状信号的缩小，以及弥散的团块状信号的出现；对CHIP在细胞内的分布和结构特征基本没有影响，但是阳性信号的细胞比例严重下降。同时，将表达VP3的真核表达载体转染DF-1细胞并研究了转染细胞中UPP各组成蛋白的表达量的变化后发现，转染细胞中UPP中的E1、UBC9、CHIP及去泛素化酶UCHL1和UCHL5在转染细胞不同生长阶段表达量上下波动，没有明显规律，这提示VP3对宿主DF-1细胞中UPP的调控作用可能主要集中在转录水平，在蛋白水平的调控可能更多地依赖于多个因子的共同作用。在分析IBDV感染对宿主蛋白酶体水解活性的影响时发现，IBDV感染不引起DF-1细胞中蛋白酶体活性的显著变化，而蛋白酶体抑制剂MG132无论持续作用还是仅作用一段时间都可以显著地降低蛋白酶体的活性。　　 4.阻断宿主UPP对IBDV感染的影响利用特异性的蛋白酶体抑制剂MG132抑制宿主UPP的降解活性后发现，病毒感染48h以内病毒基因的复制受到严重抑制，但是从48h开始抑制作用逐渐减弱，到96-120h，病毒逐渐恢复基因复制能力；从蛋白表达水平来看，感染后24-72h VP1、VP2、VP4及VP5蛋白都比未使用MG132时减少了表达量，而VP3表达量反而有所增加，提示我们VP3蛋白可能是IBDV中UPP降解的底物；MG132处理后的感染细胞中，病毒产量下降了约65％；进一步对病毒粒子装配和释放步骤分别检测后发现，MG132的抑制作用在释放阶段更强。此外，感染细胞的增殖能力也受到MG132的严重抑制，并且这种抑制效应在一定浓度范围内对MG132有剂量依赖性。