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与其他大多数RNA病毒不同,流感病毒的复制发生在宿主细胞的细胞核内。在核内合成的子代病毒核糖核蛋白复合体(vRNPs)必须经过核质转运到胞质后,才能进一步被转运到组装位点进行病毒的装配和出芽,因此流感病毒vRNPs的出核对病毒的复制周期具有重要意义。目前普遍认为流感病毒的核输出蛋白NEP(也叫非结构蛋白NS2)和基质蛋白M1对其vRNPs的出核十分关键,但是NEP蛋白和M1蛋白介导流感病毒vRNPs出核的具体机制还远未阐明。
本论文首先以A型流感病毒的核输出蛋白NEP为研究对象,鉴定了NEP蛋白中存在一个隐藏的核输出信号(NES2)。该NES位于流感病毒NEP蛋白氨基端保守的α螺旋内(氨基酸31-40),突变NES中保守的疏水性氨基酸则使其功能丧失。进一步的研究证明该NES能介导与之融合的异源蛋白的出核,并且该出核途径为出核受体hCRM1依耐性的。
本论文还研究了NEP蛋白中两个NES对NEP结合出核受体hCRM1的影响,哺乳动物双杂交的实验结果证明:缺失了NES1的NEP突变体与hCRM1的结合能力比野生型更强,缺失了NES2的NEP突变体也能与hCRM1发生结合,但是同时缺失了NES1和NES2的突变体则失去与hCRM1的结合能力。更进一步的实验证明:单独的NES2能与hCRM1发生相互作用,而单独的NES1则与hCRM1无明显的亲和力。位于NES2上游的侧翼序列对NES2与hCRM1的相互作用具有正调控作用。
另外,本论文还研究了新鉴定的NES2对流感病毒复制及病毒vRNPs出核的影响。首先我们对NES2中保守的疏水性氨基酸进行了点突变,并应用反向遗传学拯救了突变病毒9株,并对突变病毒的生长特性和vRNPs出核进行了分析。研究发现:突变体R-m9(L38A/L40A)的vRNPs的出核较野生型病毒R-wt相比,明显的受到了抑制,病毒的复制也受到了很大影响。
除以上研究内容外,本文还对流感病毒基质蛋白M1与宿主蛋白之间的相互作用进行了研究。通过酵母双杂交筛选人肾cDNA文库,筛选到能特异性地与M1蛋白发生相互作用的细胞蛋白若干种。我们对M1和hTFIIIC102-s的相互作用进行了进一步的研究。Mapping实验证明M1蛋白的N端球状结构域(氨基酸1-164)和hTFIIIC102-s蛋白的TPR1-5结构域(氨基酸149-362)对它们的相互作用是必需的。体外GSTpull-down实验和体内免疫共沉淀实验也证实了M1与hTFIIIC102-s之间的相互作用。此外,过表达hTFIIIC102-s蛋白能抑制M1蛋白的入核。这将为进一步认识流感病毒M1蛋白在流感病毒生活史中所发挥的作用提供新的线索。