第一部分TKTL1靶向RNA干扰重组体的构建及序列分析目的:本研究利用RNA干扰技术,以TKTL1为靶基因,设计构建重组体,并进行序列分析,为下一步探索肿瘤基因治疗的新途径打好基础。方法:设计有小发夹结构的两条DNA序列,经退火形成互补双链,再克隆至载体pEGFP-C1-U6中构建重组体,转化DH5а菌株,提取质粒行酶切鉴定后,进行测序分析。结果:将合成的DNA序列退火后克隆到载体上,经测序鉴定确实为所需序列。结论: TKTL1靶向RNA干扰重组体的成功构建和序列分析,可进一步利用克隆所得的小RNA序列干扰TKTL1的mRNA转录,从而达到治疗肿瘤的目的。第二部分TKTL1基因对人类结肠癌细胞株生长增殖的影响目的:探讨转酮酶样基因TKTL1在体外培养的人类结肠癌细胞株(LoVo)生长增殖中的作用。方法:将携带针对TKTL1的小干扰RNA质粒转染人类结肠癌LoVo细胞,实时定量PCR检测转染前后LoVo细胞转酮酶基因家族(TKT、TKTL1、TKTL2)mRNA表达水平的变化,连续监测法检测总转酮酶活性的变化,通过流式细胞术和MTT实验检测转染前后LoVo细胞增殖和细胞周期的改变。结果:LoVo细胞实验组(携带有pEGFP-C1-U6/TKTL1)、质粒对照组(携带有(pEGFP-C1-U6/UC)和空白对照组(未经转染细胞)中TKT和TKTL2 mRNA的表达水平无显著差异。然而,实验组细胞中TKTL1的表达水平与对照组相比明显下调,且实验组总转酮酶活性明显下降,细胞增殖明显被抑制,被阻滞在G0/G1期。结论:TKTL1在人类结肠癌细胞(LoVo细胞系)的生长增殖中起重要作用,TKTL1可作为肿瘤治疗研究的新靶点。