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磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(PI3K/Akt/m TOR)是肿瘤细胞存活及凋亡重要的信号通路,骨肉瘤以及许多其它人类癌症出现PI3K/Akt/m TOR信号通路失调。NVP-BEZ235,作为一种新的PI3K/m TOR双重抑制剂,表现出良好的抗肿瘤活性。自噬是一种细胞溶酶体降解途径,在维持细胞内稳态、调节细胞存活和死亡方面至关重要。然而,PI3K/AKT/m TOR信号还可以负调控自噬过程,抑制细胞自噬的发生,而自噬可能保护凋亡,可减少化疗药物诱导的肿瘤细胞凋亡,抑制自噬可能提高NVP-BEZ235诱导的细胞凋亡。因此在本研究中,我们考察了自噬在NVP-BEZ235引起骨肉瘤细胞凋亡过程中的作用,并探讨了相关分子机制。方法:(1)MTT方法检测NVP-BEZ235和(或)自噬抑制剂3-MA对U2OS骨肉瘤细胞存活率的影响。(2)免疫印迹(western blot)的方法检测PI3K/AKT/m TOR信号通路蛋白相关蛋白(AKT和p70S6K)、凋亡通路相关蛋白(Cytochrome C、caspase-3和PARP)以及自噬相关蛋白(LC3,Beclin 1和p62)的表达。(3)Annexin V-FITC/PI双染流式细胞仪检测细胞凋亡情况。(4)JC-1染色流式细胞仪检测细胞线粒体膜电位的变化。(5)利用Atg5 si RNA细胞转染以及自噬抑制剂3-MA考察抑制U2OS细胞自噬对NVP-BEZ235引起的细胞毒性的影响结果:(1)与瘤旁正常组织相比较,骨肉瘤组织中p-AKT和p-p70S6K表达水平明显升高。(2)NVP-BEZ235呈剂量依赖性和时间依赖性地降低U2OS细胞生存率。(3)NVP-BEZ235可以明显的增加U2OS细胞凋亡通路相关蛋白(Cytochrome C cleaved caspase-3和cleaved PARP)的表达以及增加细胞凋亡率。(4)NVP-BEZ235增加LC3,Beclin 1的表达,并下调p62的表达。(5)Atg5 si RNA细胞转染以及自噬抑制剂3-MA可以明显增强NVP-BEZ235引起的细胞生存率的下降和凋亡。结论:NVP-BEZ235可诱导骨肉瘤细胞凋亡并诱导骨肉瘤细胞发生自噬,抑制自噬可以明显增强NVP-BEZ235的骨肉瘤细胞毒作用,因此,NVP-BEZ235诱导的自噬可能是一种生存机制抵消其抗癌作用,阻断自噬可增强BEZ235的抗癌功效。本研究为NVP-BEZ235和自噬抑制剂联用治疗骨肉瘤及其他恶性肿瘤的临床开发提供了理论基础。