研究背景稀少精子冷冻是男科不育症患者治疗的重要技术保证之一。梗阻性无精症患者及重度少弱畸精症患者需要一定数量精子保障卵胞浆内单精子注射(ICSI)完成。而这类男性不育患者精子来之不易,需要反复尝试冷冻或再次手术取精,若是能在发现诊断之时将精子冷冻保存下来,则可以避免多次睾丸穿刺手术导致的疼痛、炎症、血睾屏障受损-抗精子抗体产生、瘢痕形成、性功能减退等不良并发症,更是可降低取卵日无精子可用风险。另外,近年兴起对于非梗阻性无精症患者的显微外科取精术(microdissection testicular sperm extraction,Micro-TESE),更为迫切要求改良稀少精子的冷冻技术。然而,目前对人类稀少精子冷冻复苏难度大,效果欠佳,尚无公认的冷冻方法。研究目的探索建立一种新的改良快速冷冻保存人类稀少精子的方法,为严重少弱精子症不育患者的ICSI助孕提供帮助,减少因可用精子数量不足导致辅助生殖技术(assisted reproductive technology,ART)不良结局的发生。研究方法研究第一部分,根据精子冷冻复苏理论,利用安全性好的胚胎或精子冷冻材料设计相对安全高效的改良快速冷冻载体。通过精子冷冻低温生物学验证、优化精子冷冻复苏方案参数、多次重复实验评价,建立安全高效的新的稀少精子冷冻方法,并与传统快速稀少精子冷冻方法进行高质量精子冷冻复苏的初步对比,初步判断其可行性。研究第二部分,为证明改良快速冷冻方法对稀少精子的临床应用价值,采用稀释至浓度为(1～2)×10~6/ml的混合精子进行验证其有效性及安全性。研究分两个阶段:质量正常的稀少精子与稀少弱精子实验分析。主要通过与传统的快速稀少精子冷冻方案比较冷冻复苏后精子活动力、存活率、DNA碎片、顶体酶活性及正常形态率等指标变化进行评估。研究结果第一部分稀少精子改良快速冷冻方案建立:采用麦管与胚胎专用聚丙烯薄片制作的新型快速冷冻载体与传统方法在在介质材料厚度方面更薄、温度传导速率更快;2μl微滴大小、距离液氮面3 cm平面熏蒸2 min冷冻方案为最佳冷冻参数条件;精子冷冻复苏回收率高;高质量活动精子复苏率好,可达75%以上,高于传统方法。第二部分人类稀少精子改良快速冷冻方法与传统方法对比研究发现,在活动精子冷冻复苏上高于传统方法;在对精子正常形态、膜结构、精子核结构、精子顶体功能的损伤影响小于传统快速冷冻方法。结论改良快速冷冻载体法对于稀少精子冷冻保存有一定优势,值得进一步探讨研究。