背景：缺血-再灌注（ischemia-reperfusion, I/R）损伤是临床上心脏融栓术及心外科手术后常见的心肌损伤，严重危害人类健康，近年来相关的心血管疾病（cardiovascular disease）在我国的发病率和死亡率仍有上升的趋势，而当前的治疗方法难以达到满意效果，因此探索有效的防治措施尤为重要。心肌缺血预处理（ischemic preconditioning, IP）是指在心脏经历较长时间缺血前，给予短暂的缺血-再灌注交替数次循环处理，它可以产生显著的抗I/R损伤作用，是目前发现的机体内最强大的心肌保护机制之一。与之相对应，若在缺血前给予离体心脏短暂的无钙KH缓冲液（Ca2+-free Krebs-Henseleitbuffer solution,无钙KH液）灌注处理，也可以产生显著的抗I/R损伤作用，这种方式称为无钙预处理（repetitive Ca2+depletion and repletion for shortduration，CP），它是目前许多实验室研究钙信号的重要手段，其心脏保护效应的研究是当前心血管研究领域的又一热点，但具体机制尚不清楚。显然，对IP和CP具体机制的阐明并加以利用，对缺血性心脏病（ischemic heartdisease, IHD）的防治具有重要意义。腺苷酸活化的蛋白激酶（AMP-activated protein kinase,AMPK）是细胞能量代谢的调节器，在心肌缺血时被快速激活，活化的AMPK能够促进葡萄糖摄取，加速脂肪酸（free fatty acid，FFA）氧化，抑制心肌细胞凋亡，对机体病理状态下的心脏保护具有重要意义。乙酰辅酶A羧化酶（acetylCoA carboxylase, ACC）是AMPK的下游靶分子之一，它的磷酸化水平可作为机体内AMPK活化状态的反应，AMPK可磷酸化ACC使其失活，进而抑制FFA合成，促进其氧化，在预处理心肌保护中发挥重要作用。本课题组前期研究发现，IP能够激活反向钠-钙交换体（sodium/calciumexchanger, NCX），引起胞内钙浓度短暂升高，产生心肌保护作用；IP期间采用NCX抑制剂KB-R7943阻断离体心肌细胞NCX活性，可减弱NCX激动剂E4031的心肌保护作用。同时，胞内钙浓度升高可促进蛋白激酶C（protein kinase C, PKC）活化及其向胞膜的转位，后者激活AMPK，增加葡萄糖转运体4（glucose transporter4, GLUT4）的蛋白表达，在NCX-钙预处理心肌保护效应中发挥重要作用。然而，AMPK在CP心肌保护中的作用尚不清楚，本课题在前期研究基础上，进一步探讨AMPK参与CP心肌保护的机制，及其与NCX和PKC激活之间的关系。研究结果为全面理解CP的生理学机制提供重要的理论支持，并在IHD等心血管疾病的防治方面具有重要的理论意义和临床应用价值。目的：(1)研究AMPK在CP对抗心肌I/R损伤中的作用；(2)探讨NCX和PKC是否参与AMPK介导CP的心肌保护作用。方法：成年Sprague-Dawley（SD）雄性大鼠，麻醉并肝素抗凝后，立即取心脏，行Langendorff离体心脏灌流。实验中CP采用1min缺血-5min再灌注连续3个循环处理方式，IP采用5min无钙KH液-5min正常KH液连续3个循环处理方式进行，全程记录心脏血流动力学指标，灌流结束时留取心肌组织标本。利用AcqKnowledge3.8.1（BIOPAC Systems, Inc）软件记录实验全程的血流动力学指标，利用心肌组织2，3，5-氯化三苯基四氮唑（2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride, TTC）染色方法检测心肌损伤面积，利用Western技术检测AMPK和ACC的总蛋白含量及其磷酸化水平。结果：(1) AMPK在CP和IP心脏功能保护中的作用：离体心脏在经历I/R后，左室舒张末压（left ventricular end-diastolic pressure，LVEDP）显著升高，而左室发展压（left ventricular developed pressure, LVDP）、左室内压变化（上升/下降）最大速率（maximum rates of increase and decrease in left ventricularpressure,±dp/dtmax）、心率-压力乘积（rate pressure product, RPP）和冠脉流量（coronary artery flow, CF）均明显降低；与I/R组相比，CP组和IP组心脏LVEDP明显降低，CF、LVDP、±dp/dtmax和RPP明显升高；缺血前单独使用AMPK抑制剂P5499对心脏功能和CF无显著影响，但可明显减弱CP和IP的心肌保护作用。(2) P5499是AMPK的抑制剂，10μmol/L的P5499显著减弱CP和IP心肌保护作用：离体心脏在经历I/R后，心肌损伤比例为（39.6±1.49）%；与对照预处理（Vehicle pretreatment, VP）组相比，CP组和IP组心肌损伤比例明显降低， AMPK和ACC磷酸化水平明显升高；缺血前单独使用P5499对心肌损伤面积及AMPK和ACC磷酸化水平均无显著影响，但可以明显抑制CP和IP的心肌保护作用。(3) KB-R7943（简称：KB-R）是NCX的抑制剂，3μmol/L的KB-R显著减弱CP和IP心肌保护作用：与VP组相比，CP组和IP组心肌损伤比例明显降低，AMPK和ACC磷酸化水平明显升高；缺血前单独给予KB-R对心肌损伤面积及AMPK和ACC磷酸化水平均无显著影响，但可以明显抑制CP和IP的心肌保护作用。(4) Chelerythrine chloride（简称：CHE）是PKC的抑制剂，3μmol/L的CHE显著减弱CP和IP心肌保护作用：与VP组相比，CP组和IP组心肌损伤比例明显降低， AMPK和ACC磷酸化水平明显升高；缺血前单独给予CHE对心肌损伤面积及AMPK和ACC磷酸化水平均无显著影响，但可以明显抑制CP和IP的心肌保护作用。结论：本课题在验证IP心肌保护作用中存在AMPK、NCX和PKC激活的同时，首次提出，AMPK介导了CP的心肌保护效应，并提示：在该过程中NCX和PKC作为AMPK的上游分子，可能发挥着重要作用。