1研究目的急性颅脑损伤已成为一种严重危害人类健康的疾病。颅脑继发性损伤是导致颅脑损伤病人死亡或残废的重要原因。继发性颅脑损伤发生机制十分复杂,其中创伤性脑缺血是目前研究的一个难点和热点。在防治颅脑损伤后创伤性脑缺血方面许多学者做出了很大的努力,逐渐形成了一套治疗方案,有控制血压、保持呼吸通畅、适时手术、高压氧治疗、亚低温治疗、使用促进脑细胞代谢药物等,这些措施都能在一定程度上改善创伤性脑缺血状态以及预后,但各自有其不足之处,许多方面还存在争议,有待进一步深入验证。文献调研和临床实践证实,中西医结合在防治重型颅脑损伤方面能发挥显著疗效,然而其具体的作用机理,特别是对创伤性脑缺血的防治作用机理研究报道甚少,阻碍了临床拓展运用。我科在此领域经过多年临床应用和经验积累,认为在西医常规治疗基础上,结合运用活血化瘀、豁痰开窍及通腑泻热中药,治疗重型颅脑损伤能祛瘀血、豁痰湿、泻内热、起到开窍醒脑,改善缺血缺氧状态,有效解决颅脑外伤后出现的神昏、高热、呼吸困难、肢体功能障碍、大便闭结、痰多粘稠等症状,较好地改善了预后。因此,理论上讲,在西医常规治疗基础上,结合运用活血化瘀、豁痰开窍及通腑泻热中药对于防治重型颅脑损伤后创伤性脑缺血应该有确切的作用机制和明确的临床疗效,值得我们研究证实。本研究拟从临床研究和实验研究两方面着手,就中西医结合对重型颅脑损伤后创伤性脑缺血的防治作用机理进行深入研究,为拓展其临床运用提供有价值的依据。2研究方法与结果2.1中西医结合对重型颅脑损伤后创伤性脑缺血防治作用机理的临床研究方法:我们选择自2007年1月至2009年3月在广州中医药大学第一附属医院颅脑科病房确诊的急性重型颅脑损伤住院病人80例,严格执行纳入标准和排除标准,随机分组为对照组和治疗组,从入院第1天开始,采用不同治疗处理方案,对照组采用单纯西医常规治疗,治疗组则在西医常规治疗基础上加用活血化瘀汤药鼻饲、豁痰开窍中药针剂静滴、配合通腑泻热中药灌肠治疗,从脑血管痉挛发生率、颅内血流速度变化、GCS计分变化、颅脑CT检查外伤性脑梗塞的发生率、相关安全性指标检测等方面进行连续动态观察,持续18天。数据处理,采用SPSS10.0软件包分析,计量资料用t检验,计数资料用X~2检验,显著性水平取α=0.05。结果:(1)入院后第3天两组患者MCA、ACA血流速度的均数有显著性差异(p＜0.05);第6天两组患者MCA、ACA、PCA、VA血流速度的均数有显著性差异(P＜0.05),其中以MCA流速的均数相差最大:第12天两组患者MCA、ACA、BA、VA血流速度的均数有显著性差异(P＜0.05);第18天两组患者MCA、PCA的血流速度的均数有统计学差异(P＜0.05),但差异均较小。(2)入院后第3天、第6天、第12天两组患者脑血管痉挛发生率均存在显著性差异(P＜0.05),两组血管痉挛情况随着时间延长均逐渐缓解;(3)两组患者GCS计分在入院第1天无显著性差异(P＞0.05),第3天、第6天、第12天、第18天两组患者的GCS计分均存在显著性差异(P＜0.05);(4)两组患者创伤性脑梗塞发生率分别为30.0%和10.0%,存在显著性差异(P＜0.05);(5)在治疗第6天、第12天复查血分析、肝肾功能,结果提示在用药过程中无明显毒副作用。2.2补阳还五汤促进血管内皮细胞增殖及血管新生的实验研究2.2.1补阳还五汤含药血清的制备方法:成年新西兰兔,雌雄各半,分高、中、低剂量中药组和生理盐水对照组,每天灌胃一次,连续3天采血。麻醉后无菌操作下右颈动脉采血,离心、收集血清、灭活、过滤,分组包装,低温保存。结果:本法采血前饲养动物情况良好,右颈动脉处采血每只兔可收集50ml左右新鲜血液,操作容易,采血量较多。2.2.2兔血管内皮细胞的体外原代培养与传代方法:取新西兰兔胸主动脉,外翻置于0.1%Ⅱ型胶原酶中消化收集消化液,离心收集细胞分瓶培养,72小时后换液培养;原代细胞8天左右铺满瓶底,用0.25%的胰蛋白酶消化,吹打分散,计数,分瓶传代培养。结果:原代内皮细胞48小时大部分贴壁,细胞呈小圆形、多角形,有椭圆形核,72小时伪足伸出;4-8天内细胞迅速生长,8-9天长成单层,铺满瓶底。传代细胞4—8小时内贴壁伸出伪足,7天内长成单层;10天以上呈鹅卵石样紧密排列,可见旋涡状;内皮细胞传10代以上其特征不变。2.2.3兔血管内皮细胞的鉴定试验方法:倒置相差显微镜下观察细胞分裂形成单层时的形态进行鉴定;免疫荧光法鉴定:将细胞培养在载玻片上形成单层贴片,经酒精、ⅧR—Ag、羊抗鼠IgG及荧光标记的SABC作用,放于荧光显微镜下观察,并作阴性对照。结果:内皮细胞呈小圆形、多角形,有椭圆形核。免疫荧光法可见大量的绿色细胞,细胞浆、膜上有明显染色,细胞核无染色。2.2.4兔血管内皮细胞的增殖及药物血清的作用方法:用MTT法测细胞增殖,绘制细胞生长曲线;将不同剂量不同浓度药物血清作用促进细胞增殖,比较不同剂量不同浓度药物血清的作用效果。结果:5—8天为快速增长期,10天左右达到增殖的高峰,11—14天后增殖呈平坦趋势。相同剂量不同浓度中10%含药血清组、20%含药血清组较5%的含药血清组有统计学差异(P＜0.05);相同浓度不同剂量中剂量组与低剂量组,高剂量组与低剂量组间有统计学差异(P＜0.05)。2.2.5兔血管内皮细胞分裂指数的测定方法:采用Giemsa染色法,先于低倍光镜下选择分散较好、细胞核着色清楚而胞质无色的细胞,再转到高倍镜下观察细胞是否处于分裂期;每个样本计数1000个以上的细胞,记录分裂期细胞数和间期细胞数,再计算细胞分裂指数。结果:细胞在培养阶段中80%以上的细胞处于细胞间期,20%以下的细胞处于分裂期。不同含药血清培养的内皮细胞均较空白组细胞的分裂指数增加,增加幅度组间有差异;各组6-8天达到分裂高峰,以后分裂指数逐步下降,11-12天降至1%左右。2.2.6兔血管内皮细胞的透射电镜观察方法:用不同剂量含药血清培养干预细胞后,准备细胞样品,用JEM-200CX透射电镜观察内皮细胞形态,包括细胞核、细胞器、细胞浆、细胞内脂滴大小分布等。结果:含药血清细胞较空白组细胞排列明显紧密,细胞核较大,染色质清晰;胞质内粗面内质网增生扩张;线粒体相对发达,嵴结构及嵴上颗粒清晰;亦有大量吞饮小泡,细胞间有内皮细胞间连接或桥粒,可见细胞内有大糖原颗粒和细胞特殊颗粒等。2.2.7补阳还五汤含药血清促进鸡胚绒毛尿囊膜血管生成的试验方法:将高、中、低剂量中药含药血清及空白对照血清作为被测物置于鸡胚绒毛尿囊膜表面的载体上,作用充分后后制备CAM标本,解剖显微镜下观察、计算机图像分析仪图像分析,得到相关定量数据,进一步统计学分析。结果:含药血清具有明显的促进鸡胚绒毛尿囊膜血管生成的作用,用药组较空白组有显著性差异。3结论3.1重型颅脑损伤后创伤性脑缺血的中医病机可概括为气滞血瘀,痰瘀热交结,闭阻清窍。3.2在西医治疗基础上结合活血化瘀汤药鼻饲、豁痰开窍针剂静滴及通腑泻热中药灌肠,能降低脑外伤后颅内血流速度,防治脑血管痉挛,减少脑梗塞发生率,改善脑缺血状态,提高GCS评分,改善预后,且对患者无明显肝肾功能损害,安全有效。3.3补阳还五汤可能通过改善血管内皮细胞能量合成,促进细胞新陈代谢及功能活动,诱导产生促进内皮细胞增殖的生长因子来促进血管内皮细胞增殖;可能激活血管内皮及外膜细胞,促进其分裂、出芽和迁移,启动血管新生程序,促进内皮细胞分化及细胞连接,形成原始血管腔,并进一步促进新生血管稳定和成熟来促进血管新生。3.4综合临床和实验研究:中西医结合对重型颅脑损伤后创伤性脑缺血有显著的防治效果,其作用机理之一,可能是通过保护受损脑微血管内皮细胞,促进内皮细胞增殖和迁移,修复受损微血管,并在缺血区域促进生成新血管,提高局部脑血流,改善脑微循环,从而保护脑组织和神经功能。4.本课题的特点和创新性4.1在西医常规治疗基础上运用活血化瘀、豁痰开窍及通腑泻热中药联合用药防治重型颅脑损伤后创伤性脑缺血是一个治疗理念的创新。4.2对重型颅脑损伤后创伤性脑缺血的病机认识,我们第一次完整概括为气滞血瘀,痰瘀热交结,闭阻清窍。4.3将中药血清药理学、血管内皮细胞培养及鸡胚绒毛尿囊膜血管生成实验等相结合,应用到中医药防治创伤性脑缺血机理的研究,是一个全新的尝试。