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背景:肝脏移植是治疗终末期肝脏疾病的唯一有效方法。缺血再灌注(I/R)损伤在肝脏移植过程中不可避免,是肝移植术后移植物功能障碍的重要原因。研究报道,缺血再灌注损伤可导致肝移植术后早期移植物功能不良、原发性移植物无功能、缺血型胆道损伤、移植术后肝癌复发以及重症监护时间显著延长等。此外,缺血再灌注损伤还可导致移植术后急性肾损伤及移植术后心律失常。现阶段,临床上为减轻肝脏缺血再灌注损伤,提高手术成功率以及患者存活率,常采用的方法有缺血预处理或通过药物预处理等,但上述方法均存在一定的局限性。因此,当前仍迫切需要进一步阐明肝脏缺血再灌注损伤发生发展过程中的机制,以期为其治疗提供新靶点以及新思路。目前,国内外研究一致认为肝脏缺血再灌注损伤分为缺血和再灌注两个典型的阶段,具有独特的组织损伤机制。在缺血阶段随着ATP的可用性降低,ATP依赖的离子通道开始失效,细胞代谢率下降,无氧糖酵解激活,肝细胞迅速死亡。再灌注损伤涉及直接和间接的细胞毒性机制,在此阶段肝脏产生活性氧刺激炎症反应,包括巨噬细胞和中性粒细胞浸润和细胞因子的产生,最终造成肝细胞凋亡、坏死。所以,过度的炎症反应和广泛的细胞凋亡是肝脏缺血再灌注损伤过程中的两个重要因素。因此,如何减轻肝脏缺血再灌注损伤过程炎症反应和细胞凋亡对于提高供体质量,改善肝脏移植预后尤为重要。TRIM家族蛋白在调控细胞增殖和凋亡、先天免疫和炎症反应等多种生物学过程发挥重要作用,该家族蛋白结构包含由RING结构域、B-box结构域和卷曲螺旋结构域组成的三结构域。TRIM27作为TRIM家族蛋白的一种,于1988年首次报道为RET原癌基因的融合蛋白。研究报道,TRIM27通过抑制由IKKα/β/ε介导的NF-κB和IFN激活来负调节抗病毒和炎症反应。此外,敲低TRIM27可通过上调p-p38诱导卵巢癌细胞的细胞凋亡。但是,TRIM27在肝脏缺血再灌注损伤中是否以及如何发挥作用尚不清楚。因此,研究TRIM27在肝脏缺血再灌注损伤中的作用有利于阐明肝脏缺血再灌注损伤的机制,为肝脏缺血再灌注损伤的保护奠定理论基础和提供新的药物靶点。本研究分为三个部分从体内、体外及临床水平探讨了 TRIM27对肝脏缺血再灌注损伤的保护作用及其分子机制,为临床肝脏缺血再灌注损伤的保护奠定理论基础和提供新的药物靶点。第一部分:TRIM27在肝脏缺血再灌注损伤中的表达相关性研究目的:探索TRIM27在肝脏缺血再灌注损伤中的表达相关性。方法:1.1收集临床肝脏移植病人供体肝脏冷灌注前及移植肝脏恢复灌注后关腹前的肝组织样本,通过Western-blot、免疫组化及RT-PCR检测TRIM27的蛋白及基因水平表达变化。1.2建立小鼠肝脏缺血再灌注模型,通过Western-blot、免疫组化及RT-PCR检测小鼠肝脏缺血再灌注后的肝组织中TRIM27的蛋白及基因水平表达变化。1.3建立肝细胞缺氧/复氧模型,通过Western-blot检测肝细胞缺氧/复氧后TRIM27的表达变化。结果:在临床肝移植样本中,与供体肝脏灌注前的肝组织样本相比,肝移植恢复灌注后的肝组织中TRIM27基因及蛋白的表达显著下调;与假手术组相比,小鼠肝脏缺血再灌注损伤后的肝组织中TRIM27基因及蛋白的表达显著下调;与对照组相比,肝细胞缺氧/复氧后TRIM27的蛋白表达显著下调。结论:TRIM27在肝脏缺血再灌注后表达显著下调,提示其在肝脏缺血再灌注损伤中发挥重要作用。第二部分:TRIM27对肝脏缺血再灌注损伤中炎症反应和细胞凋亡的调控作用研究目的:探索在TRIM27对肝脏缺血再灌注损伤过程中炎症反应和细胞凋亡的调控作用。方法:1.检测TRIM27对小鼠肝脏缺血再灌注后肝损伤的调控作用1.1构建Trim27基因敲除(Trim27-KO)小鼠,建立肝脏缺血再灌注损伤模型。通过Western-blot检测TRIM27的敲除效率;通过全自动生化分析仪检测小鼠血清中谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)的含量;通过苏木素-伊红染色(H&E)评估小鼠肝组织坏死面积和坏死程度。1.2构建肝细胞特异性TRIM27转基因(Trim27-HTG)小鼠,建立肝脏缺血再灌注损伤模型。通过Western-blot检测TRIM27的表达;通过全自动生化分析仪检测小鼠血清中谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)的含量;通过H&E染色评估小鼠肝组织坏死面积和坏死程度。2.检测TRIM27对小鼠肝脏缺血再灌注损伤过程炎症反应的调控作用2.1采用Trim27-KO及WT小鼠,建立肝脏缺血再灌注损伤模型。通过CD1 lb免疫荧光检测小鼠肝组织中炎症细胞浸润;通过RT-PCR检测肝组织中Tnfα、Il6、IL11b、Ccl2、Cxcl2等炎症因子的基因表达;通过Western-blot检测NF-κB信号通路相关分子的蛋白表达。2.2通过慢病毒感染构建TRIM27敲低稳转肝细胞系,建立肝细胞缺氧/复氧模型。通过RT-PCR及Western-blot检测TRIM27敲低效率;通过RT-PCR检测Tnfα、Il6、Il1b等炎症因子的基因表达。2.3采用Trim27-HTG及NTG小鼠,建立肝脏缺血再灌注损伤模型。通过CD1 1b免疫荧光检测肝组织炎症细胞浸润;通过RT-PCR检测肝组织中Tnfα、Il6、Il1b、Ccl2、Cxcl2等炎症因子的基因表达;通过Western-blot检测NF-κB信号通路相关分子的蛋白表达。2.4通过慢病毒感染构建TRIM27过表达的稳转肝细胞系,建立肝细胞缺氧/复氧模型。通过RT-PCR及Western-blot检测TRIM27的过表达效率;通过RT-PCR检测Tnfα、Il6、Il1b等炎症因子的基因表达。3.检测TRIM27对小鼠肝脏缺血再灌注损伤过程细胞凋亡的调控作用3.1采用Trim27-KO及WT小鼠,建立肝脏缺血再灌注损伤模型。通过TUNEL免疫荧光及c-CASPASE-3免疫组化检测肝组织细胞凋亡;通过RT-PCR检测肝组织中Bad、Bαx、Bcl2等凋亡相关基因的表达;通过Western-blot检测肝组织中BAX、BAD、BCL2及c-CASPASE-3等凋亡相关蛋白的表达。3.2通过慢病毒感染构建TRIM27敲低稳转肝细胞系,建立肝细胞缺氧/复氧模型。通过RT-PCR检测Bαx、Bcl2等凋亡相关基因的表达。3.3采用Trim27-HTG及NTG小鼠,建立肝脏缺血再灌注损伤模型。通过TUNEL免疫荧光及c-CASPASE-3免疫组化检测肝组织细胞凋亡;通过RT-PCR检测肝组织中Bad、Bαx、Bcl2等凋亡相关基因的表达;通过Western-blot检测肝组织中BAX、BAD、BCL2及c-CASPASE-3等凋亡相关蛋白的表达。3.4通过慢病毒感染构建TRIM27过表达的稳转肝细胞系,建立肝细胞缺氧/复氧模型。通过RT-PCR检测Bαx、Bcl2等凋亡相关基因的表达。结果:1.TRIM27显著减轻肝脏缺血再灌注后肝损伤与WT组相比,Trim27-KO组小鼠肝脏缺血再灌注损伤后血清转氨酶(ALT、AST)显著升高,肝组织坏死面积显著扩大;与NTG组相比,Trim27-HTG组小鼠肝脏缺血再灌注损伤后血清转氨酶(ALT、AST)显著降低,肝组织坏死面积显著减小。2.TRIM27显著抑制肝脏缺血再灌注损伤过程的炎症反应与WT组相比,Trim27-KO组小鼠肝脏缺血再灌注损伤后肝组织中CD11b阳性炎症细胞浸润明显加重,肝组织中Tnfα、Il6、Il1b Ccl2、Cxcl2等炎症因子的基因表达显著上调,NFκB信号通路被激活;与对照组相比,TRIM27敲低组肝细胞缺氧/复氧后Tnfα、Il6、Il1b等炎症因子基因表达显著上调。与NTG组相比,Trim27-HTG组小鼠肝脏缺血再灌注损伤后肝组织中CD1 1b阳性炎症细胞浸润明显减少,肝组织中Tnfα、Il6、Il1b、Ccl2、Cxcl2等炎症因子基因表达显著下调,NFκB信号通路被抑制;与对照组相比,TRIM27过表达组肝细胞缺氧/复氧后Tnfα、Il6、Il1b等炎症因子基因表达显著下调。3.TRIM27显著抑制肝脏缺血再灌注损伤过程的细胞凋亡与WT组相比,Trim27-KO组小鼠肝脏缺血再灌注损伤后肝组织中TUNEL及c-CASPASE-3 阳性凋亡细胞显著增多,肝组织中促凋亡分子BAX、BAD、c-CASPASE-3基因和蛋白表达显著上调,抗凋亡因子BCL2基因和蛋白表达显著下调;与对照组相比,TRIM27敲低组肝细胞缺氧/复氧后促凋亡因子Bax基因表达显著上调,抗凋亡因子Bcl2基因表达显著下调。与NTG组相比,Trim27-HTG组小鼠肝脏缺血再灌注损伤后肝组织中TUNEL及c-CASPASE-3阳性凋亡细胞显著减少,肝组织中促凋亡因子BAX、BAD、c-CASPASE-3基因和蛋白表达显著下调,抗凋亡因子BCL2基因和蛋白的表达显著上调;与对照组相比,TRIM27过表达组肝细胞缺氧/复氧后促凋亡因子Bax基因表达显著下调,抗凋亡因子Bcl2基因表达显著上调。结论:TRIM27可以显著抑制肝脏缺血再灌注损伤过程的炎症反应和细胞凋亡从而减轻肝脏缺血再灌注损伤。第三部分:TRIM27通过TAK1-JNK/p38信号轴调控肝脏缺血再灌注损伤的机制研究目的:阐明TRIM27通过TAK1-JNK/p38信号轴调控肝脏缺血再灌注损伤的分子机制。方法:1.通过高通量测序探索TRIM27调控肝脏缺血再灌注损伤的可能机制1.1 通过高通量测序筛选Trim27-KO及WT组小鼠肝脏缺血再灌注后肝组织中差异基因;通过京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路分析富集Trim27敲除后差异基因相关信号通路变化;通过热图分析参与基因探针富集分析(GSEA)途径的炎症基因的表达变化。1.2采用Trim27-KO及WT小鼠,建立肝脏缺血再灌注损伤模型。通过Western-blot 检测肝组织中 ASK1、TAK1、ERK、JNK、p38 等 MAPK 信号通路相关分子总蛋白和磷酸化蛋白的变化;通过慢病毒感染构建TRIM27敲低稳转肝细胞系,建立肝细胞缺氧/复氧模型。通过Western-blot检测TAK1、JNK、p38等MAPK信号通路相关分子总蛋白和磷酸化蛋白的变化。1.3采用Trim27-HTG及NTG小鼠,建立肝脏缺血再灌注损伤模型。通过Western-blot 检测肝组织中 ASK1、TAK1、ERK、JNK、p38 等 MAPK 信号通路相关分子总蛋白和磷酸化蛋白的变化;通过慢病毒感染构建TRIM27过表达的稳转肝细胞系,建立肝细胞缺氧/复氧模型。通过Western-blot检测TAK1、JNK、p38等MAPK信号通路相关分子总蛋白和磷酸化蛋白的变化。2.检测TRIM27对肝脏缺血再灌注损伤的调控是否依赖于TAK12.1通过慢病毒感染构建TRIM27敲低稳转肝细胞系,同时加入TAK1抑制剂NG25,建立肝细胞缺氧/复氧模型。通过RT-PCR检测Tnfα、Il6、Il1b等炎症因子以及Bax、Bcl2等凋亡相关基因的表达。2.2通过细胞免疫荧光,在激光共聚焦显微镜下观察TRIM27和TAK1在肝细胞中的共定位;通过免疫共沉淀(Co-IP)实验检测TRIM27和TAK1的是否互作;通过GST-pulldown实验检测TRIM27和TAK1的直接相互作用;通过mapping实验检测TRIM27和TAK1相互作用的具体结构域。3.检测TAB2/3在TRIM27-TAK1介导的肝脏缺血再灌注损伤中的作用3.1 在 HEK293T 细胞中转染 Myc-Ub、HA-TAK1 和 Flag-TRIM27 质粒,检测TRIM27对TAK1泛素化水平的影响。3.2通过免疫共沉淀实验检测TRIM27和TAB2/3的相互作用。3.3 在 HEK293T 细胞中梯度转染 Myc-TRIM27 及 HA-TAB2 或 Flag-TAB3,检测TRIM27对TAB2/3蛋白稳定性的影响。3.4 在 HEK293T 细胞中梯度转染 Myc-TRIM27 及 HA-TAB2 或 Flag-TAB3,同时分别加入DMSO、MG132、CQ,检测TRIM27影响TAB2/3蛋白稳定性的的途径。3.5在HEK293T细胞中检测TRIM27对TAB2/3介导的TAK1泛素化激活的影响,以及肝细胞缺氧/复氧后TRIM27在TAB2/3介导的TAK1磷酸化激活中的作用。结果:1.TRIM27抑制肝脏缺血再灌注损伤后TAK1-JNK/p38信号通路的激活高通量测序发现和WT组相比,Trim27-KO小鼠肝脏缺血再灌注损伤后的肝组织中存在大量差异基因,同时MAPK信号通路显著富集,ASK1和TAK1表达显著上调。Western-blot发现与WT组相比,Trim27-KO组小鼠肝脏缺血再灌注损伤后肝组织中p-TAK1、p-JNK、p-p38蛋白表达显著上调;与对照组相比,TRIM27敲低组肝细胞缺氧/复氧后p-TAK1、p-JNK、p-p38的蛋白表达显著上调。与NTG组相比,Trim27-HTG组小鼠肝脏缺血再灌注损伤后肝组织中p-TAK1、p-JNK、p-p38的蛋白表达显著下调;与对照组相比,TRIM27过表达组肝细胞缺氧/复氧后p-TAK1、p-JNK、p-p38的蛋白表达显著下调。2.TRIM27对肝脏缺血再灌注损伤的调控作用依赖于TAK1TRIM27敲低可以显著促进肝细胞缺氧/复氧后的炎症反应和细胞凋亡,加入TAK1抑制剂NG25之后可以抵消TRIM27敲低的促炎和促凋亡作用。TRIM27和TAK1在肝细胞细胞质共定位;免疫共沉淀和GST-pulldown实验证实TRIM27和TAK1可以直接相互作用;Mapping实验证实TRIM27的C端的133-513氨基酸序列和TAK1的N端1-480的氨基酸序列相互结合。3.TRIM27通过降解TAB2/3抑制TAK1的激活TRIM27可以抑制TAK1的K630位点的泛素化水平;TRIM27分别和TAB2/TAB3互作;TRIM27可以通过溶酶体途径降解TAB2/3;TRIM27可以抑制TAB2/3介导的TAK1的泛素化和磷酸化激活。结论:TRIM27通过降解TAB2/3进而抑制TAK1-JNK/p38信号通路从而调控肝脏缺血再灌注损伤。