目的:肝癌是发病率高、死亡率高的恶性肿瘤。对肝癌的多组学研究发现了以胆酸异常为特征的肝癌亚型。酒精是肝癌的诱发因素之一。长期过量饮酒严重危害人类的健康,是许多疾病如酒精性肝病、酒精性胰腺炎、酒精性心肌炎等发生的诱因。近年来,随着中国经济的发展,人民生活水平不断提高,饮酒过量越来越严重,并呈现年轻化的趋势,酗酒、嗜酒、酒依赖逐渐呈现普遍性。据统计,中国32%的男性和4%的女性存在过度饮酒,而每年死于酒精中毒的人数己经超过11万人,占总死亡率的1.3%;因酒精而致残的人数已经超过273万,占总致残率的3.0%。研究发现,高酒精摄入与胆酸淤积密切相关。而人体内胆酸的稳态主要受其合成、排泄、代谢和肝肠循环的影响,那么酒精是通过影响胆酸体内稳态的哪些关键的环节来引起胆酸紊乱,且其调控胆酸稳态失衡的机制尚不清楚。长期饮酒引起酒精耐受性增加、戒断症状产生、酒依赖等生物学性状的改变,但控制这些生物学性状的基因却未发生改变,进而推断长期饮酒可能引起基因表观修饰的改变,从而引起表型以及生物学性状发生了改变。而目前尚无酒精通过表观遗传学调控机体内胆酸稳态的相关研究。因此,基于目前的研究现状,本课题将探讨酒精调控胆酸稳态的机制,并初步阐述表观遗传学在酒精调控胆酸稳态机制中的作用和意义。方法:1.考察37例肝癌患者中饮酒和非饮酒对体内胆酸的影响通过对收集的37例肝癌病例进行分类,分为饮酒和非饮酒两类,用质谱方法检测其中18种胆酸含量的变化。2.检测临床病例中饮酒和非饮酒胆酸相关基因的表达采用RT-PCR方法检测饮酒和非饮酒病例中胆酸相关基因FXRa、BSEP、NTCP、CYP7A1等的表达。3.酒精对肝癌细胞的生物学作用在肝癌细胞Huh7,HepG2上面验证酒精对其的生物学效应,用MTT和SRB法验证不同浓度酒精对其活力具有抑制作用。质谱检测酒精处理后不同时间点胆汁酸含量的变化,确定时间点后进一步验证酒精对胆酸相关蛋白BSEP、FXRα、CYP7A1和CYP8B1蛋白表达水平影响。4.从表观遗传学角度考察酒精对肝癌细胞的生物学效应采用垂直电泳和实时定量PCR仪检测不同酒精浓度（0,0.1%,0.25%,0.5%）的表观遗传学关键效应蛋白。通过RT-PCR和Western bolt考查表观遗传学组蛋白甲基转移酶组蛋白去甲基化转移酶等,筛选酒精调控胆酸相关基因的表观遗传学靶点。5.用动物模型验证酒精对动物体内胆汁酸水平的影响通过FVB小鼠模型研究胆汁酸变化和肝病的关系。质谱和RT-PCR检测胆汁中胆酸含量和肝脏中胆酸相关基因变化。6.统计学分析采用SPSS19.0统计学软件进行数据分析对照,多组间均数比较采用One way ANOVA,P<0.05表示具有显著学差异。运用Graph Pad 5.0数据分析软件作图,数据结果以Mean±SD表示。结果:1.在肝癌病例中,饮酒者体内的胆酸稳态发生了显著紊乱在肝癌组织中,通过质谱检测其中胆汁酸的含量。结果发现饮酒者肝癌组织中胆汁酸GCA,TCA,CDCA,TCDCA,GDCA显著升高,HCA,TDCA,TLCA显著降低。2.在肝癌病例中,饮酒者病例中发现BSEP基因下降通过RT-PCR检测37例肝癌组织中的胆酸相关基因表达,发现胆酸相关基因发生变化,其中饮酒者体内BSEP基因低表达。3.在肝癌细胞中,酒精摄入引起胆酸紊乱通过MTT和SRB实验,筛选不同浓度酒精进行后续的机制研究,发现在不同肝癌细胞中,随着时间和浓度的增加,对细胞的活力有抑制作用。通过Western blot检测不同时间点胆酸相关基因的表达。通过Western blot发现酒精在肝癌细胞中引起胆酸蛋白表达水平的变化,并且降低BSEP的表达。4.酒精在表观遗传水平上调KDM5B的表达通过Western blot发现酒精组蛋白甲基转移酶、组蛋白去甲基转移酶和组蛋白去乙酰化酶等表观遗传酶,发现酒精能够引起表观遗传学甲基化修饰过程。并且在上调KDM5B的蛋白和基因表达水平。5.动物模型验证酒精对动物体内胆汁酸水平的影响。在FVB小鼠体内,给予8%的酒精,降低胆酸CA的含量,调控胆酸相关基因发生变化。在肝组织里面,BSEP、FXR、NTCP、CYP8B1表达下降。结论:本研究在病例肝癌组织、肝癌细胞和动物体内,发现了酒精和胆酸紊乱的相关性。并且发现了关键基因BSEP。我们在体内外探讨酒精在胆酸紊乱中的作用机制。在肝癌细胞中,发现酒精摄入能够引起BSEP的改变和影响表观遗传相关酶的变化。在肝损伤模型中,酒精影响胆酸相关基因的表达。酒精在肝癌细胞、动物和病例组织中影响胆汁酸的改变,并且抑制胆酸转运体BSEP蛋白和基因的表达。发现BSEP的低表达与肝癌的进展有密切关联。