论文部分内容阅读
胆汁淤积性肝病是由肝脏内外原因导致胆汁生成或排泄障碍引发胆汁在肝脏中堆积,造成肝脏损害的一类疾病,临床上认为ALP超过正常上限1.5倍,且GGT超过正常上限3倍,可诊断胆汁淤积性肝病[1],目前关于胆汁淤积性肝病的治疗都基于病因解除,但对于一些致病机制不清楚的胆汁淤积性肝病例如PBC,PSC等,并没有较好的治疗药物。因此了解胆汁淤积的发病机制对于寻找这些疾病有效的治疗药物有着重要的意义,本课题组前期利用PBC患者胆管侧细胞膜做免疫原,通过单克隆抗体制备获得一株单抗mAb1F9,经过鉴定该抗体识别的是溶酶体相关膜蛋白2即LAMP2分子。课题组前期研究发现LAMP2在胆汁淤积患者血清中明显升高,且UDCA治疗后三个月血清中LAMP2的变化可以用来评判PBC患者是否对UDCA应答。同时利用TALENs技术成功构建了LAMP2全身敲除大鼠,发现LAMP2敲除大鼠发生了胆汁淤积的表型,且肝脏组织中与胆汁排泄相关的转运分子MRP2定位发生改变。这些结果提示LAMP2和胆汁排泄有密切关系,但是LAMP2是如何参与胆汁排泄和影响转运分子MRP2的定位呢?我们将通过以下实验进行探索。研究内容1.鉴于LAMP2敲除大鼠为全身基因敲除大鼠并出现全身性疾病,为判断敲除大鼠组织中MRP2分子的定位改变是否由LAMP2直接引起还是全身疾病的并发症,我们将从大鼠原代细胞层面来观察LAMP2对MRP2分子定位的影响。首先我们利用胶原酶灌注法将大鼠原代细胞分离出来,再用胶原三明治培养方法培养肝细胞,观察胆管形成过程,待其胆管结构稳定时再利用细胞免疫荧光技术观察MRP2在LAMP2敲除大鼠和对照组中的定位。为了检测原代肝细胞中MRP2的转运功能如何,我们利用直接免疫荧光法观察MRP2对其荧光底物CMFDA的转运效能。通过观察细胞内和胆管侧荧光强度值来评价MRP2的转运功能。2.为了更好的探索LAMP2对MRP2的影响,我们选择了能够形成胆管的肝癌细胞系HepG2进行体外研究,用LAMP2-siRNA慢病毒感染细胞构建LAMP2下调的细胞系,利用qRT-PCR和Western blot技术检测敲减效率。然后通过免疫荧光观察胆管的形态、数量和各极性分子的定位,利用CD59转吞实验(transcytosis)观察细胞间接转运途径,最后通过间接免疫荧光法观察MRP2与初级内体标志物EEA1的共定位情况,以了解异常定位的MRP2储存在哪里。3.为了观察LAMP2各个亚型对MRP2分子的定位影响。我们利用craspre基因编辑技术构建LAMP2A,LAMP2B敲除的HepG2细胞系,并通过Western blot和qRT-PCR,普通PCR,对细胞进行鉴定,细胞鉴定成功后通过免疫荧光法观察MRP2的定位是否发生改变。研究结果1.将大鼠原代细胞分离出来后,用胶原三明治培养法培养细胞,在加入胶原后细胞慢慢形成小的胆管,随着培养时间的延长可以看到肝细胞胆管形成越来越多而且结构也越稳定,在第五天时我们比较了敲除大鼠原代肝细胞与对照组相比胆管形成数量和胆管形态并没有明显差异,但是MRP2的定位却发生了改变,表现为在敲除大鼠原代肝细胞中不仅在胆管膜上有定位,而在细胞内也弥散了大量的MRP2存在,而对照组几乎完全定位在胆管膜上。同时对MRP2的转运功能检测发现,正常大鼠肝细胞可以将细胞内的CMFDA很快的转运到胆管侧,而敲除LAMP2后肝细胞内储存大量CMFDA不能排出,这表明敲除LAMP2后肝细胞MRP2分子转运功能受限。2.利用LAMP2-siRNA慢病毒我们成功构建LAMP2敲减的HepG2细胞系,我们发现敲减LAMP2后对HepG2的胆管形成数量没有差异,但是胆管形态却发生了改变。同时发现在下调LAMP2后MRP2的定位也发生了改变,表现为MRP2几乎都弥散在细胞内,而对照组细胞MRP2基本都定位在细胞胆管膜上,不仅如此,LAMP2下调后也引起了其他极性分子MDR1、BSEP定位的改变,而这些分子与MRP2都是通过直接运输途径插入(insertion)到胆管膜上,随后我们观察了通过间接通路上膜的分子CD59,发现下调LAMP2后也引起了该分子的运输障碍,这提示我们LAMP2是影响了细胞内分子运输机制才导致MRP2的定位改变。我们还发现异常定位的MRP2大量的储存在初级内体中。这提示LAMP2影响肝细胞内分子运输可能是通过影响细胞内体融合功能。3.经过Western blot和qRT-PCR,普通PCR技术验证,我们成功构建了LAMP2A、LAMP2B敲除的HepG2细胞系,随后发现两种亚型敲除的细胞系都引起了MRP2定位的改变。结论1.本实验通过体外大鼠原代肝细胞实验确定了LAMP2确实参与调控了MRP2在胆管膜上的正确定位,并且会影响MRP2转运功能的正常发挥,从而引起胆汁排泄障碍,2.进一步通过人源性肝癌细胞系HepG2进行研究发现LAMP2参与调控了肝细胞内分子运输系统机制,进而导致MRP2定位异常,而这种调控可能是通过影响肝细胞内体融合功能而导致。3.我们成功构建了LAMP2分子的亚型LAMP2A、LAMP2B分别敲除的HepG2细胞系并且两个亚型都对MRP2的定位产生影响。