论文部分内容阅读
目的探讨花旗松素(taxifolin,Tax)对毒死蜱(chlorpyrifos,CPF)诱导的BV2细胞神经毒性的保护机制,为小儿神经系统疾病的预防和治疗提供新的思路。方法(1)BV2细胞随机分为4组,因CPF和Tax均为脂溶性,易溶于DMSO,故设置DMSO组为对照组:DMSO组:含0.1%DMSO的RPMI 1640完全培养基处理细胞,根据实验要求设置不同时间点;CPF组:含200μmol/L CPF的RPMI 1640完全培养基处理细胞,作用时间6 h;Tax组:含Tax的RPMI 1640完全培养基预处理细胞,根据实验要求设置不同浓度、不同时间点;Tax+CPF组:含100μmol/L Tax的RPMI 1640完全培养基预处理细胞,作用时间6 h;再用含200μmol/L CPF的RPMI 1640完全培养基处理细胞,作用时间6 h。(2)CCK-8法检测Tax对BV2细胞活力的影响;光镜下观察细胞形态学变化;(3)荧光染色法检测BV2细胞内活性氧(reactiveoxygenspecies,ROS)水平;(4)酶联免疫吸附法(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测细胞上清TNF-α和IFN-γ蛋白表达;(5)免疫荧光染色(Immunofluorescence staining,IF)检测自噬标志性蛋白LC3Ⅱ表达;(6)免疫印迹法(Western blot)检测p-AMPK,AMPK,Nrf2,HO-1,p62蛋白表达水平以及Conpound C阻断AMPK通路后,再次检测上述蛋白表达水平。结果(1)光镜下可见CPF诱导的BV2细胞胞体变圆,细胞突触萎缩,且贴壁性变差,细胞聚集漂浮;Tax、Tax+CPF两组BV2细胞形态较为靠近DMSO组,贴壁性较CPF组好,无明显聚集现象。(2)荧光显微镜下观察可见DMSO组绿色荧光很少且亮度较弱,CPF组绿色荧光较多且亮度增强,而Tax和Tax+CPF灵族细胞绿色荧光减少且荧光亮度减弱。与DMSO组比较,CPF组ROS增多(P<0.001),Tax、Tax+CPF组ROS无增多(P>0.05);与CPF组比较,Tax、Tax+CPF组ROS降低(P<0.05)。(3)ELISA检测各组细胞上清液中TNF-α和IFN-γ水平示:与DMSO组比较,CPF、Tax+CPF两组细胞TNF-α和IFN-γ水平升高(P?0.05),Tax组细胞TNF-α水平无升高(P>0.05),IFN-γ水平升高(P?0.05);与CPF组比较,Tax和Tax+CPF组细胞TNF-α和IFN-γ的水平均有下降(P?0.05)。(4)免疫荧光染色.结果示:LC3 II主要在细胞质中表达,与DMSO组比较,CPF组细胞LC3 II在细胞质中表达未见增多,Tax和Tax+CPF两组细胞LC3 II在细胞质中表达增多。同时,western blot实验结果示:与DMSO组比较,CPF组细胞p62相对表达无显著差异(P>0.05);Tax组细胞p62相对表达量增多(P?0.05),Tax+CPF组细胞p62下降,但差异无统计学意义(P>0.05)。(5)western blot实验结果示:与DMSO组比较,CPF组AMPK、p-AMPK、Nrf2、HO-1蛋白表达无明显改变(P>0.05),Tax组AMPK、p-AMPK蛋白表达无显著改变(P>0.05),Nrf2、HO-1蛋白表达减少,但差异无统计学意义(P>0.05),Tax+CPF组AMPK蛋白无显著改变,p-AMPK蛋白表达减少(P?0.05),Nrf2、HO-1蛋白表达无显著增加(P>0.05);与CPF组比较,Tax组AMPK、p-AMPK、Nrf2、HO-1蛋白表达无显著改变(P>0.05),Tax+CPF组p-AMPK蛋白表达减少(P?0.05),Nrf2、HO-1蛋白表达增加,但差异无统计学意义(P>0.05)。Conpound C干预各组BV2细胞1 h后,实验结果可见与DMSO组比较,CPF组AMPK蛋白表达显著减少(P?0.05),Tax组AMPK、Nrf2蛋白表达明显减少(P?0.05),p-AMPK、HO-1蛋白表达减少,但差异无统计学意义(P>0.05),Tax+CPF组AMPK、p-AMPK显著较少(P?0.05),Nrf2、HO-1蛋白表达无显著差异(P>0.05);与CPF组比较,Tax组AMPK显著升高(P?0.05),p-AMPK、Nrf2、HO-1蛋白表达无显著差异(P>0.05),Tax+CPF组AMPK、p-AMPK、Nrf2、HO-1蛋白表达无显著差异(P>0.05)。结论(1)CPF对BV2细胞具有毒性作用,表现为BV2细胞胞体变圆,细胞突触萎缩,且贴壁性变差,细胞聚集漂浮,BV2细胞存活率降低。同时,CPF可以上调ROS、TNF-α、IFN-γ水平,诱导BV2细胞发生氧化应激、炎症反应。(2)Tax可以改善BV2细胞活力,对CPF诱导BV2细胞神经毒性具有保护作用;Tax下调ROS、TNF-α、IFN-γ、p62水平,上调LC3II水平,提示Tax可以减轻炎症及氧化应激反应、促进自噬,对CPF诱导的BV2细胞毒性发挥保护作用。(3)Tax下调p-AMPK水平,上调Nrf2、HO-1水平,提示Tax对CPF诱导的BV2细胞毒性的保护机制可能是通过下调p-AMPK水平,激活Nrf2/HO-1信号通路实现。