论文部分内容阅读
前言 组织工程构建关节软骨已经成为关节骨科研究的热点，然而软骨组织工程过程尚需进一步完善。本实验采用体外培养人关节软骨细胞，然后以bFGF及IGF-1对其处理，研究他们对人关节软骨细胞的作用以及明确二者之间的相互作用关系。 材料与方法 1．软骨细胞的原代培养 取材：本实验所用软骨均取自中国医科大学附属第一医院骨科手术的正常成人关节软骨。无菌条件下获取关节表面的关节软骨，PBS缓冲液冲洗干净后放入盛有DMEM培养基的培养皿中，用眼科剪刀及锐刀将软骨切成1mm3的碎块。 原代培养：碎软骨块中加入0.25％胰蛋白酶，37℃消化20min，再以DMEM液终止消化。加入0.02％Ⅱ型胶原酶消化后，以200目不锈钢筛网过滤。将过滤后的细胞悬液以1500rpm离心5min，去上清，加入DMEM培养基重悬，重复3次。细胞计数并检查细胞活力，按105个细胞／ml密度接种到培养瓶，37℃混合气体（体积分数分别为5％CO2和95％O2）及饱和湿度条件下培养，细胞贴壁后每隔3～4d更换培养液。 细胞传代：细胞在培养瓶中生长到80％～90％汇合时，倒掉培养液，加入数滴0.25％胰蛋白酶覆盖细胞，加入适量DMEM培养液，吹打细胞均匀后分瓶，继续置于CO2恒温孵育箱中培养。 2．原代软骨细胞鉴定 软骨细胞接种于处理过的盖玻片上。细胞克隆爬片以4％多聚甲醛固定15min，新鲜配制0.5％H2O2／甲醇室温处理30min，灭活内源性过氧化物酶，进行检测。阳性对照用关节软骨组织，阴性对照用PBS代替一抗。 软骨细胞爬片上滴加正常山羊血清封闭液，室温20min。甩去多余液体，不洗； 滴加兔抗人11型胶原单克隆抗体，37℃恒温箱20而n。PBs洗涤Zminx3次; 滴加生物素化山羊抗鼠IgG，37℃恒温箱Zomin。PBS洗涤Zmin x3次; 滴加SABC，37℃恒温箱20min。PBS洗涤30min x4次; 二氨基联苯胺（DAB）显色，苏木素复染。充分水洗; 酒精脱水，二甲苯透明，封片。 3.生长因子作用 在基础培养基中加人bFGF（10ng/耐）为处理因素l，或加人IGF一1（loon剔ml）为处理因素2。用此培养基培养软骨细胞。本实验分组如下:bFGF组在培养时以处理因素1作用;IGF一1组在培养时以处理因素2作用;bFGF*IGF一1组在培养时先以处理因素1作用，在更换培养液时加人处理因素2;对照组加基础培养液培养作为对照组。因此，本实验分为4个实验组。4组细胞均以上述培养基培养1周。 4.光镜观察 在倒置显微镜下观察软骨细胞的形态、数量以及细胞外基质的分布情况。 5.MTI’法检测（生长因子对软骨细胞数量的影响） 共分为4组。软骨细胞按常规培养，取第二代软骨细胞，用含有10%新生小牛血清的DMEM培养液配成单个细胞悬液，以每孔3 xl扩个细胞接种于96孔培养板中，每组6孔，每孔200闪; 培养并以生长因子作用细胞:按前述方法，在COZ恒温孵育箱中培养软骨细胞并应用生长因子作用。 呈色:培养终止前，每孔加人sm扩mlM竹溶液20闪，继续培养4h，终止培养，小心吸去孔内培养上清液。每孔加人150闪DMso，振荡10min，使结晶物充分溶解; 比色:选择490nm波长，参考波长620nm，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值（OD值），记录结果。 6.软骨细胞n型胶原免疫细胞化学检测 如前述分为4组。细胞接种于处理的盖玻片上，每组6片。细胞克隆爬片以4%多聚甲醛固定巧min，新鲜配制0.5%H:仇/甲醇室温处理30min，灭活内源性过氧化物酶，进行检测。 ①软骨细胞爬片上滴加正常山羊血清封闭液，室温30min。甩去多余液体，不洗; ②滴加兔抗人n型胶原单克隆抗体，37℃恒温箱60min。PBs洗涤smin x3次; ③滴加生物素化山羊抗兔IgG，37℃恒温箱Zomin。PBs洗涤5而。x3次; ④滴加SABC，室温20min。PBS洗涤smin xs次; ⑤二氨基联苯胺（DAB）显色，苏木素复染。充分水洗; ⑥酒精脱水，二甲苯透明，封片。 阳性对照用关节软骨组织，阴性对照用PBS代替一抗。 灰度值测定:细胞爬片以Olympus（日本）图像采集系统采集后，随机选取视野用MetaMorph（美国）图像分析软件分析灰度值，同时记录平均值，灰度值随表达量的增多而减小。结果 在体外培养软骨细胞时应用bFGF（ 10n岁nil）可以明显促进细胞增殖，但同时发生去分化。 在体外培养软骨细胞时应用IGF一l（loon岁而）可以明显促进细胞产生细胞外基质，有利于软骨细胞表型的表达，对细胞的增殖作用不明显。 采用顺序性应用bFGF（10n岁祖）和IGF一1（loon岁nil）对体外培养的软骨细胞进行作用，可以在更短的时间内获得大量的、具有良好细胞表型的软骨细胞，有利于组织工程化软骨的构建。讨论 以往研究认为，软骨细胞修复关节软骨缺损能获得很好的效果。实验证明不仅年幼的且年老的关节软骨也可在体外培养出新生透明软骨。目前，软骨细胞是最直观的组织工程修复的细胞来源，它能分泌形成关节软骨所必需的n型胶原和蛋白多糖（proteoglycan，PG）等基质大分子。但自体关节软?