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目的丙酮酸激酶PKM2在恶性肿瘤代谢方面起着重要作用,其介导的Warburg效应可以为肿瘤细胞的快速增殖提供足够的能量和大量的代谢中间产物。人端粒酶逆转录酶hTERT在大多数恶性肿瘤中具有活性并赋予细胞无限增殖的能力。本研究目的在于研究丙酮酸激酶PKM2在肝癌细胞增殖过程中的功能,探究PKM2与人端粒酶逆转录酶hTERT的关系,并进一步阐明PKM2调节hTERT的分子机制。方法1.细胞增殖能力检测：在肝癌细胞HepG2中转染阴性对照或PKM2 siRNA后72h分别计数300个细胞进行克隆形成实验,培养10天后结晶紫染色,观察克隆形成数目变化。在干扰PKM2后分别在24h、48h、72h时通过CCK-8实验检测细胞活性,检测PKM2干扰对细胞增殖的影响。2.PKM2与hTERT的联系在HepG2中转染阴性对照或PKM2 siRNA72h后,分别提取RNA和蛋白,qRT-PCR检测PKM2mRNA干扰效果、hTERTmRNA表达情况,Western Blotting检测PKM2蛋白干扰效果,ELISA检测端粒酶活性。构建野生型hTERT核心启动子活性报告质粒,在转入阴性对照或PKM2 siRNA 24h后转入内参海肾荧光素表达质粒TK,同时转入hTERT启动子报告质粒,48h后检测萤火虫荧光和海肾荧光,检测PKM2干扰对hTERT启动子活性的影响。3.PKM2调控hTERT分子机制转入阴性对照或PKM2 siRNA72h后,检测Sp1在mRNA水平和蛋白水平的变化,ChIP检测干扰PKM2后SP1与hTERT启动子区域结合的变化。构建hTERT启动子区域SP1结合位点单位点突变型启动子报告质粒,在转入PKM2siRNA 24h后转入TK和突变型质粒,检测萤火虫荧光和海肾荧光。4.PKM1与hTERT的关系以及分子调控机制在HepG2中转染阴性对照或PKM1siRNA 72h后,转染空载质粒或PKM1表达质粒48h后,分别提取细胞RNA和蛋白,在mRNA和蛋白水平检测PKM1表达情况,在mRNA水平检测hTERT、转录因子Sp1的变化,以及在mRNA和蛋白水平检测另一个经典hTERT转录因子c-Myc和上游分子β-catenin的表达情况。结果1.在肝癌细胞HepG2中干扰PKM2后,细胞克隆形成能力降低,CCK-8实验证明PKM2干扰组活细胞数比阴性对照组少,证明降低PKM2抑制肝癌细胞HepG2的增殖能力。2.干扰PKM2后hTERT转录水平下降,其启动子活性、mRNA表达、端粒酶活性均降低。3.干扰PKM2后hTERT主要转录因子Sp1在mRNA、蛋白水平表达均降低,hTERT启动子SP1结合位点单位点突变后部分逆转PKM2对hTERT启动子活性的调节作用,ChIP实验结果表明干扰PKM2后SP1与hTERT启动子序列结合减少。4.干扰PKM1后hTERT mRNA水平上升,转录因子Sp1 mRNA水平无明显变化,而c-Myc和其上游调控因子P-catenin表达升高,高表达PKM1后hTERT mRNA水平降低,c-Myc和P-catenin表达也降低。结论1.PKM2促进肝癌细胞HepG2的增殖。2.PKM2正向调节hTERT转录活性,并且通过影响其上游转录因子SP1与hTERT启动子的结合来调节其转录。3.PKM1负向调控hTERT mRNA表达水平,并且可能通过β-catenin-c-Myc信号途径调节hTERT表达。