铜是维持生物体正常生理活动所必需的微量元素，其缺乏或过量都会引起严重的身体缺陷和病症，如免疫功能下降、引起糖尿病、冠心病、高脂血症、骨质疏松和肿瘤等。对铜代谢遗传病肝豆状核变性（铜中毒）的治疗多采用二巯基丙磺酸钠、青霉胺、曲锌制剂和四硫铝酸盐等驱铜剂进行医治，或采用还原剂谷胱甘肽以减轻过量铜对机体的氧化损伤，但该治疗手段仅能局部缓解症状，并不能从根本上治愈该疾病，且常会恶化神经症状。因此深入研究铜代谢解毒机理，有效降低机体内铜含量，是治愈该病症的重要途径。同时，随着社会和工业的发展，越来越多的铜排入环境中，农田环境中过量铜可破坏土壤的物理化学性质，抑制农作物生长，减少产量和养分，过量铜还可通过食物链进一步危害人类健康，所以了解铜在生物体的代谢规律和及解毒机制将有助于铜中毒的治疗和铜污染土壤的生物修复。目前，虽然已有研究显示在生物体内由铜、sp1（铜感受器）和hctr1（铜吸收转运蛋白）共同调节铜的稳态，但是多细胞生物体内铜代谢的复杂网络途径尚不清楚。　　秀丽隐杆线虫作为经典的模式生物已广泛应用于遗传学、毒理学、神经生物学和发育生物学等方面的研究。本文以模式生物秀丽隐杆线虫为研究对象，从铜对秀丽隐杆线虫的毒性效应、抗氧化酶系在铜代谢解毒过程中的作用、肠道铜吸收基因的筛选和鉴定、抗铜突变体筛选和基因定位及秀丽隐杆线虫对铜的行为变化等几方面研究秀丽隐杆线虫对铜的代谢解毒机制，主要研究内容如下：　　一、铜对秀丽隐杆线虫的毒性效应　　本文系统研究了过量铜对秀丽隐杆线虫的毒性效应。研究结果显示，过量铜可对线虫造成多重生物学毒性效应，包括表皮褶皱、产卵孔萎缩、生殖腺萎缩、产卵率降低、发育延迟和发育异常等。同时本文发现秀丽隐杆线虫卵在母虫体内孵化的袋线虫（Bags-of-worms）表型是铜毒性效应的结果，袋线虫的形成提高了后代的成活率。秀丽隐杆线虫对过量铜的表型变化可作为毒性效应观察分析的直接指标，并应用于本文对秀丽隐杆线虫铜突变体的正向和反向遗传筛选实验中。　　二、秀丽隐杆线虫抗氧化酶系在对过量铜解毒代谢中的作用　　铜对机体的危害主要是氧化损伤，因此抗氧化酶在铜的解毒代谢过程中发挥着重要作用。本文采用酶活测定、实时荧光定量PCR和遗传突变体等方法，检测了过量铜所引发的线虫体内抗氧化酶活性及其基因表达量的变化。结果显示，SOD（超氧化物歧化酶）在0.1、0.2、0.4mmol/L CuSO4处理下活性最高，CAT（过氧化氢酶）在0.1、0.2、0.4和0.8mmol/L CuSO4处理下活性最高，GPX（谷胱甘肽过氧化物酶）则随着CuSO4浓度的增高，活性越趋升高，而GST（谷胱甘肽-S转移酶）的活性则下降。对SOD、CAT和GPX mRNA表达量的进一步研究表明SOD-3、SOD-5、CTL-1、CTL-2、GPX-1、GPX-2、GPX-3、GPX-4、GPX-6、GPX-7、GPX-8基因的表达量显著升高。而sod-5，ctl-1，gpx-3，gpx-4，gpx-6缺失突变体的LC50显著降低，表明在铜解毒过程中上述基因具有重要的生理功能。同时过表达SOD-1、SOD-2、SOD-3或CAT均可增加秀丽隐杆线虫对铜的抗性，表明非铜应答抗氧化酶也参与到消除过量铜引起的氧化损伤过程。　　三、秀丽隐杆线虫胰岛素信号通路的抗铜特性分析　　已知胰岛素/胰岛素样生长因子（Insulin/IGF-1）信号通路，作为抗氧化酶的负调控因子，不仅与秀丽隐杆线虫的寿命相关，同时也参与抗逆性生理功能。本文采用酶活测定、实时荧光定量PCR和遗传突变体等方法研究了daf-2和age-1突变体抗氧化酶系对铜的应答和对铜的敏感性，结果表明上述突变体不仅可以延长虫体的寿命，同时也增强了虫体抗铜性。当与daf-16双突变后，铜抗表型减弱或消失，说明其抗性主要通过daf-16介导的；daf-2的抗性显著高于age-1的抗性，推测在daf-2的下游还有平行于age-1的通路存在；同时这些突变体内的SOD、CAT和GPX活性仍然可以被过量铜诱导提高，daf-2突变体中，SOD-3、SOD-5和CTL-1基因可被过量铜诱导，提高表达量；age-1突变体中，SOD-4、CTL-1、CTL-2、CTL-3、GPX-1和GPX-8基因可被过量铜诱导表达；daf-16突变体中，SOD-2、SOD-4、SOD-5、GPX-1和GPX-8基因可被过量铜诱导表达，在daf-2、age-1、daf-16突变体中，不同的抗氧化酶基因参与了过量铜的应答，表明其是一个复杂的调控网络，当接触抑制因子后，各种激活调控因子协同作用，以提高抗氧化酶的活性，缓解过量铜引起的氧化损伤。　　四、秀丽隐杆线虫抗铜基因的克隆、定位及功能研究　　目前已知，细胞吸收铜离子的蛋白为CTR（铜转运蛋白），但是对于CTR在肠道细胞中的定位及是否参与人肠道铜吸收转运还存在争议。在秀丽隐杆线虫中虽有10个同源基因，但是其分子特性和功能还未准确鉴定。本文对这10个基因进行反向遗传筛选，其中2个基因在RNAi之后，秀丽隐杆线虫增强了对铜的抗性，分别命名为ctr-1和ctr-2。构建其上游2k调控序列和C端GFP（Green fluorescent protein）融合表达蛋白转基因品系，发现CTR-1位于肠道细胞顶端膜上，CTR-2位于肠道细胞质囊泡上。ctr-1和ctr-2突变体增强了虫体对铜的抗性，而过表达转基因品系可增强对铜的敏感性，因此ctr-1可能直接参与秀丽隐杆线虫肠道铜的吸收，CTR-2可能间接参与虫体肠道铜的吸收。这一结果表明CTR-1可能定位于秀丽隐杆线虫肠道细胞顶端膜上，从食物中吸收铜离子。　　五、秀丽隐杆线虫抗铜突变体的筛选与SNP定位　　为了进一步探索多细胞生物体内铜代谢的复杂调控网络，本文采用正向遗传方法筛选铜抗突变体。首先铜影响线虫的正常发育，这一表型可实现在体式显微镜下对线虫铜抗突变体的大规模筛选。确定筛选培养基的浓度，通过氨基磺酸乙酯（EMS）诱变L4时期的线虫P0，F2卵放在筛选培养基上，进行大规模（约10万个杂合基因组）的筛选，得到2个抗铜突变体ms1和ms2。在筛选培养基上野生型停止发育，而抗铜突变体则可发育到成虫，且抗铜性状能稳定遗传。与N2的回交实验表明，ms1的抗铜表型可能由单基因隐性突变导致，ms2的抗铜表型消失，可能是由多基因突变所引起。以CB4856和ms1作亲本，构建了F2群，经SNP定位，确定ms1突变位点位于LG:II号染色体上，进一步对LG:II号染色体上的8个SNP标记进行分析，将ms1的突变位点定位在LG:II,-6附近。已经报道的与铜抗有关的基因均不在这个区域，因此其可能是新的基因或已知基因新的功能。秀丽隐杆线虫抗铜突变体ms1的筛选和定位可为深入研究线虫铜代谢及调控的分子机制提供实验依据。　　六、CTR-3可能参与秀丽隐杆线虫对铜的趋避性行为　　为了阐明秀丽隐杆线虫线虫对铜趋避行为的分子机制及其他CTR基因的功能，本文采用反向遗传筛选方法获得介导秀丽隐杆线虫对铜趋避行为的基因ctr-3，当其表达量降低时线虫对铜的趋避指数显著降低，同时对奎宁的趋避指数也随之降低，但对组氨酸的趋向指数并未产生显著变化。构建其自身2k调控区和C端绿色荧光蛋白融合蛋白研究显示，其在趋避神经元ASH中也有表达，推测可能是影响了趋避化学感受器ASH的功能。