背景溃疡性结肠炎为发生于肠道的慢性非特异性炎症,病程迁延不愈,发病机制复杂,B细胞功能的失衡被认为在溃疡性结肠炎的发病中具有重要作用。目前溃疡性结肠炎仍缺乏有效治疗手段,近年来干细胞治疗在溃疡性结肠炎中得到应用。取自月经血的子宫内膜再生细胞(Endometrial Regenerative Cells,ERC)作为干细胞新来源,不但具有自我更新潜能、间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells,MSC)样表型特征、免疫调节作用,还具有取材无创、来源相对无限、增殖能力强、避免伦理问题的独特优势。ERC是否可以影响B细胞功能,并通过诱导调节性B细胞(Regulatory B cells,Breg)在结肠炎中发挥保护作用仍有待阐明。目的1.从育龄志愿者妇女月经血中获取ERC,建立从分离、培养、传代、冻存和复苏的方法体系;2.体外明确ERC对B细胞的作用;3.利用葡聚糖硫酸钠建立小鼠结肠炎模型,探讨ERC对结肠炎小鼠体内B细胞的免疫调节作用;4.探究输注的ERC在体内的分布,明确其如何发挥对B细胞的免疫调节作用;5.通过过继治疗的方法探讨ERC是否通过Breg发挥保护作用。方法第一部分:从健康育龄志愿者妇女月经血中分离ERC在健康育龄妇女月经期第2-3日,通过月事杯采集月经血。以密度梯度离心法分离单个核细胞层,并进行体外培养传代扩增。应用流式细胞术,对ERC的免疫表型进行鉴定。第二部分:ERC体外调节B细胞功能磁珠分选小鼠脾脏CD19+B淋巴细胞,在ERC存在或缺失的条件下,以LPS作为刺激剂构建培养体系。通过3H-胸腺嘧啶核苷酸掺入法检测B细胞的增殖。通过台盼蓝拒染法检测B细胞活性,并经Annexin V、7-AAD染色后通过流式检测B细胞凋亡。流式检测B细胞表面与其活化相关的分子表达。收集培养体系上清液,ELISA法检测上清液中IgM和IgG的含量。收集悬浮的B细胞并经固定破膜,流式检测IL-10+的调节性B细胞比例,ELISA法检测上清液中IL-10的含量。第三部分:ERC调节B细胞功能在结肠炎中的治疗作用造模方法:3%葡聚糖硫酸钠自由饮用的方法诱导Balb/c小鼠结肠炎模型。实验分组:将6-8周龄,体重18-22g的雄性Balb/c小鼠随机分为3组,每组6-8只:(1)正常对照组:小鼠自由饮用蒸馏水;(2)DSS模型未治疗组:自由饮用含3%DSS的蒸馏水7天,随后更换蒸馏水,造模第2、5、8日经尾静脉输注200μl PBS;(3)ERC治疗组:自由饮用含3%DSS的蒸馏水7天,随后更换蒸馏水,造模第2、5、8日经尾静脉输注200μl含有1×106 ERCs的PBS。每日记录小鼠生存情况,测量体重,并观察其一般情况、大便性状与便血情况,计算DAI评分,以评估疾病活动性。造模第10日取材,测量结肠长度,HE染色观察结肠病理损伤。ELISA法检测结肠匀浆液中炎性因子水平。Western blot法和PCR法检测脾脏IL-10的蛋白水平及mRNA转录水平。流式细胞术分析脾脏、肠系膜淋巴结、腹腔灌洗液中免疫细胞比例。PKH26荧光标记ERCs,活体成像检测输入体内后的分布情况。分离具有免疫抑制功能的Breg,通过过继治疗探究ERC是否通过该种细胞发挥保护作用。结果第一部分:从健康育龄妇女月经血中分离ERC通过密度梯度离心法成功从健康育龄妇女月经血中获取ERC。3天后初次换液可见贴壁的原代细胞。随生长逐渐拉伸具有梭形外观,汇合后呈编织状或漩涡状结构。传代后细胞生长增殖速度加快,倍增时间约为24小时。约3代后,其生物学特性及形态学特征趋于一致。流式检测表明ERC具有类似于MSC的分子表型,表达CD90和CD105,而不表达造血干细胞特异性抗原CD34和CD45。且经传代、冻存及复苏之后仍稳定具备此表型。第二部分:ERC体外调节B细胞功能ERC可在不影响B细胞活性的情况下,体外抑制LPS诱导的B淋巴细胞多克隆增殖,且不增加B细胞凋亡。同时ERC可抑制B细胞活化及分泌抗体,并具有剂量依赖的特点。随ERC与B细胞数量比增加,其抑制效应也进一步增强。另一方面,ERC可诱导具有免疫抑制功能的Breg产生及IL-10的分泌。第三部分:ERC通过调节B细胞的功能在结肠炎中发挥治疗作用ERC可提高结肠炎小鼠生存率,降低体重下降幅度,一般状况恶化及大便性状改变或发生便血的时间晚于DSS模型组,且程度较轻,更换饮用水后迅速恢复。大体标本显示,ERC治疗组小鼠结肠长度缩短较少,且大体病理改变(包括肠管僵直、肠壁充血、近端结肠扩张及远端结肠狭窄情况)较轻。HE染色表明,ERC可减轻DSS造成的小鼠结肠炎症病理改变。黏膜结构较完整,黏膜及黏膜下层炎性细胞浸润情况显著低于DSS模型组,充血及水肿情况明显减轻。同时ERC可显著降低结肠炎小鼠炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-6水平,提高具有抗炎作用的IL-10水平。ERC限制结肠炎小鼠脾脏T淋巴细胞过度增殖,降低CD3+T淋巴细胞的比例,以减少CD4+T淋巴细胞比例更为显著,并提高调节性T细胞比例。同时,ERC抑制脾脏B淋巴细胞分化为浆细胞,减轻结肠炎小鼠肠道组织中IgG抗体的沉积,降低肠道匀浆上清液中IgG的含量。ERC可提高结肠炎小鼠脾脏中IL-10+CD19+Breg比例,提高CD1dhiB细胞在脾脏、腹腔以及肠系膜淋巴结中的比例。同时ERC治疗后小鼠脾脏CD1dhiCD5+B淋巴细胞显著增多,且为IL-10的重要来源。从ERC治疗后的结肠炎小鼠脾脏中分离获得CD1dhiCD5+B淋巴细胞,经过继治疗后,可有效缓解结肠炎症状,促进肠道恢复。ERC在小鼠结肠、肠系膜淋巴结、肝脏、肾脏、脾脏及肺脏均有所富集。其中远端结肠和肠系膜淋巴结富集最为显著。说明ERC注射入体后,主要分布在炎症反应部位以及炎症引流的淋巴组织。结论1.建立ERC分离培养体系,ERC具有梭形形态及MSC样表型特征,可在体外大量扩增。2.ERC可体外抑制B细胞的增殖、活化、抗体分泌,诱导Breg产生。3.成功利用DSS所诱导的结肠炎模型,阐明ERC可减轻结肠炎症状、促进恢复,并减轻肠道病理损伤和炎症反应。4.输入体内的ERC可募集于炎症损伤部位及炎症引流的淋巴组织。5.ERC可调控免疫细胞平衡,抑制DSS结肠炎模型中B细胞分化为浆细胞及抗体的沉积,另一方面诱导具有免疫调节作用的Breg产生。6.过继治疗结果表明,ERC可能通过诱导Breg发挥其在结肠炎中的治疗作用。