基于差异蛋白质组学和酶学的两种甲虫生长发育分子机制研究

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我们分别采用比较蛋白质组学和酶学方法研究了中华豆芫菁Epicauta chinensis和赤拟谷盗Tribolium castaneum两种鞘翅目昆虫的生长发育分子机制。通过对中华豆芫菁1-5龄幼虫进行比较蛋白质组学研究,获得了42个差异蛋白质。在这些差异蛋白中,卵黄原蛋白(Vg)、二氢硫辛酸脱氢酶(DLD)、溶菌酶C(Lmz-S)对幼虫的发育均具有非常重要的作用。Vg是中华豆芫菁卵和幼虫早期发育的主要营养来源,具有免疫活性,该蛋白在1-4龄幼虫体内一直表达,但伪蛹滞育期不表达,它的合成受保幼激素(JH)和食物因子的调控;DLD催化丙酮酸生成乙酰辅酶A,而后者是合成JH的甲羟戊酸途径的初始物质。因此,DLD可能间接影响JH和Vg的生物合成。2-DE检测结果表明1、2龄幼虫体内DLD的酶活性比3、4、5龄偏低;溶菌酶C有防御、免疫功能,其活性高低是昆虫免疫力强弱的一个重要指标,此酶在1龄幼虫体内活性最低。另外,本研究还发现了Wnt信号通路的一个负调控因子APR-1,它的过量表达会导致昆虫的眼、卵、足以及雌虫卵巢异位或畸形,此蛋白在2龄幼虫体内表达量最高,之后又下调至极低水平。对其中5个差异蛋白基因在mRNA水平的表达情况进行了研究,结果发现只有热休克同源蛋白70在两个水平的表达比较一致。对中华豆芫菁成虫羽化初期0、6、12日龄中肠和去除中肠、翅的其余部位的研究共成功鉴定出64个差异蛋白质,发现了一些对昆虫生长发育非常重要的差异蛋白质。其中,于成虫中肠发现的具消化吸收功能的3种蛋白质,如葡萄糖苷酶、羧肽酶D前体物和中性α葡萄糖苷酶ab前体物,它们在0日龄雄虫中肠活性极低,随着羽化时间的增长而不断增强,12日龄达最强;具抗氧化与解毒作用的蛋白共10个,包括硫氧还蛋白还原酶及其过氧化物酶、谷胱甘肽过氧化物酶、电子传递黄素蛋白α亚基、金属硫蛋白和乙醇脱氢酶等,防御免疫功能的蛋白3个,分别为免疫调节因子、多酚氧化酶酶原和抗增殖蛋白,这两种功能的蛋白在6、12日龄成虫体内的表达量均明显比0日龄高;参与中华豆芫菁生长发育的表皮生长因子受体和参与脂肪酸合成的3-氧酰基-酰基载体蛋白还原酶,在0日龄表达量最低,6日龄达到最高峰;抑制保幼激素合成的咽侧体抑制素前体在中肠的表达量随日龄增加呈不断增高趋势。蛋白与mRNA水平的表达结果显示,选取的10个差异蛋白基因中只有3个与蛋白的表达趋势比较一致,由此反应了翻译与转录水平之间复杂的关系。分别用LC10和LC25亚致死剂量的甲酸乙酯处理赤拟谷盗成虫12h、24h、48h、72h和96h,研究发现赤拟谷盗体内的P450酶和AChE活性在LC10剂量诱导72h内显著升高,而LC25剂量诱导72h内,它们的活性则被抑制;CarE舌性在LC10剂量诱导48h时显著提高,LC25剂量处理48h之内活性显著降低,72h时恢复正常,96h时重新被激活;GST活性在两亚致死剂量处理的12-72h内均显著上升;而ALP活性在两个亚致死剂量处理下均未发生显著变化。赤拟谷盗CYP4BN1、AChE1GstD2此3个基因在两个亚致死剂量的甲酸乙酯熏蒸72-96h内一直处于被激活的状态,它们可能参与了赤拟谷盗对甲酸乙酯的主要代谢过程;LC10浓度的药剂诱导est2表达,但LC25却显著抑制其表达;48h处理时间内,两剂量药剂均促进Hsp68的表达,LC25促进Hsp27表达,而LC10则抑制Hsp27表达。这两个热激蛋白基因可能在不同的剂量和诱导时间下各自发挥抵抗药剂胁迫的作用。选择42-51℃高温和4℃低温分别处理赤拟谷盗成虫,研究高、低温胁迫对试虫P450酶、CarE、AChE、GST此4种代谢酶的活性影响以及对代谢酶基因和热激蛋白基因表达的影响,结果表明:赤拟谷盗P450、CarE、AChE、GST这4种解毒酶的活性在高温与低温诱导下均被显著抑制;高温抑制而低温促进CYP4BN1表达;51℃高温和4℃低温促进est2表达;高温诱导促进Hsp68和Hsp27的表达,短时间内低温会促进Hsp68却抑制Hsp27表达。就它们的作用而言,CYP4BN1、est2和Hsp68均可能有助于赤拟谷盗减轻低温胁迫带来的伤害,Hsp68和Hsp27可能在机体抵抗高温胁迫时起作用,est2还可能有助于试虫抵抗高温。通过对中华豆芫菁的研究,建立了中华豆芫菁幼虫和成虫的双向电泳图谱数据库,分析并探讨了差异蛋白质的功能,同时研究了部分差异蛋白基因的在转录水平的表达情况,初步了解其体内蛋白质和RNA的瞬时表达与积累效应的分子发生机制,为今后在分子水平更深入地研究芫菁的滞育与生物合成斑蝥素奠定基础。从酶学角度出发,系统地研究了甲酸乙酯熏蒸和温度胁迫等逆境条件对赤拟谷盗成虫生长发育的影响,探讨了逆境胁迫对试虫产生亚致死效应的生理与分子机制,为今后在生产实践中更高效地防治储粮害虫做理论指导。
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