论文部分内容阅读
中国大鲵(Chinese giant salamander,Andrias davidianus)是我国二级保护动物,也是世界上现存最大的两栖动物。大鲵属于野生动物从水生动物向陆生动物过渡的物种,其在研究物种起源、进化,生物多样性、基因变异等方面具有重要的科学意义。不仅如此,近年来我国大鲵人工养殖规模的不断扩大,由大鲵虹彩病毒(Chinese giant salamander iridovirus,GSIV)引起的病毒性疾病给大鲵的养殖业造成了巨大的经济损失,因而研究大鲵抗病毒防御机制对其病毒性疾病的防控具有重要的意义。Mx蛋白是由干扰素诱导产生的效应因子,因其具有抵抗黏液病毒的能力而命名编码Mx蛋白的基因为Mx(myxovirus resistance)基因。Mx蛋白广泛存在于脊椎动物与无脊椎动物体内,在各组织内广泛表达,且具有广谱的抗病毒活性。目前,Mx基因在哺乳动物、禽类、鱼类等的研究中都有相关报道,而两栖类动物Mx的抗病毒功能研究鲜有报道。本文以中国大鲵为研究对象,采用RT-PCR技术研究了Mx基因在大鲵不同组织中的表达模式及GSIV感染后在不同组织及细胞中的表达模式;通过构建真核表达载体,转染GSM细胞,并进行细胞形态学观察、dd PCR检测GSIV MCP基因拷贝和Western blotting检测MCP蛋白合成情况验证其抗病毒功能,旨在为大鲵免疫防御系统与抗病毒感染机制的研究奠定基础。主要结果如下:1.大鲵Mx(Ad Mx)基因的克隆及c DNA序列分析以大鲵脾脏组织c DNA为模板,利用RACE技术克隆得到大鲵Mx(Ad Mx)c DNA全长。运用生物信息学分析Ad Mx的序列特征,其全长2848 bp,包含5’非翻译区(UTR,untranslated region)132 bp,3’非翻译区604 bp,开放阅读框为2112 bp,编码703个氨基酸。氨基酸序列分析显示Ad Mx序列具有33个氨基酸长度的信号肽,预测其蛋白分子量大小为79.09 KD,等电点为5.33。与其他物种的Mx基因编码的蛋白相似,在肽链N末端发现了高度保守的超蛋白动力家族三联体GTP结合区域和发动蛋白家族的典型结构特征序列。通过与Gen Bank中已录入的脊椎动物Mx基因序列进行比对,核苷酸序列的同源性为55.0%-77.0%。系统进化树结果显示Ad Mx与非洲爪蟾的Mx1聚为一支。2.Ad Mx基因的组织表达分布与诱导表达实时荧光定量PCR分析结果显示:Ad Mx在被检测的健康大鲵的8个组织(肝脏、肾脏、脾脏、心脏、肌肉、胸腺、肠和脑)中均有表达,其中在脑中的表达量最高、脾脏、肾脏、胸腺和心脏中表达量较高,在肌肉、胸腺和心脏中表达较低。GSIV感染后,Ad Mx在脾脏和肾脏中的表达水平在12 h时显著升高,48 h时达到峰值。在肌肉中,Ad Mx表达水平在48 h和72 h显著升高。在体外,GSM细胞感染GSIV后,与对照GSM细胞相比,Ad Mx在72 h时达到最高表达水平。3.Ad Mx基因真核载体的构建及功能研究构建真核表达质粒p EGFP-N1-Ad Mx并转染至大鲵肌肉细胞(Chinese giant salamander muscle cell,GSM),Western blotting和免疫荧光实验结果表明,重组质粒p EGFP-N1-Ad Mx在GSM细胞中成功表达且定位于细胞质中。GSIV感染细胞实验结果表明,Ad Mx能显著抑制GSIV感染GSM细胞后的细胞病变效应(Cytopathic effect,CPE);过表达Ad Mx基因的细胞感染GSIV 24 h和48 h后,GSIV MCP基因拷贝数较对照组分别下调6倍和2.5倍;Western blotting结果显示,过表达Ad Mx的细胞中GSIV MCP蛋白的合成与对照组相比明显降低。以上结果均表明,过表达Ad Mx能够明显抑制GSIV的复制,且具有显著的抗病毒功能。