论文部分内容阅读
前言:血脑屏障(blood brain barrier, BBB)是维系中枢神经系统内环境稳态的重要屏障结构。血脑屏障功能的变化主要与内皮细胞间的紧密连接密切相关。内皮细胞间的紧密连接使大多数大分子物质被阻挡在中枢神经系统外，只允许水和部分小分子物质以浓度梯度扩散以及主动运输的方式通过，以维持中枢神经系统的稳态。本实验室曾在研究新生儿细菌性脑膜炎的发病机制时发现了P190，它是人脑微血管内皮细胞膜表面的IbeA蛋白受体，可与IbeA配体结合有利于细菌内化到脑微血管内皮细胞中，但脑微血管内皮细胞表达P190的生理意义尚不清楚。实验室人员前期研究发现，P190可以影响GEF-H1的表达及其磷酸化，进而影响体外BBB模型的通透性，但GEF-H1磷酸化的具体位点未知。因此，本研究将进一步鉴定P190导致GEF-H1磷酸化的位点，同时在分析P190于脑血管发育过程中表达的基础上，制备内皮细胞中P190条件性敲除小鼠，以便为体内研究BBB通透性打基础。 研究方法:1.体外培养人脑微血管内皮细胞胞内段缺失稳转细胞系(HBMEC△C)，检测磷酸酶的活性。2.在人脑微血管内皮细胞(HBMEC)中敲减P190的表达，检测磷酸酶活性。3.通过克隆技术体外构建GEF-H1截短质粒。4.在cos7细胞中共转GEF-H1截短质粒和P190全长质粒以检测P190对于GEF-H1磷酸化的影响。5.通过免疫沉淀以及蛋白质免疫印迹实验检测GEF-H1丝氨酸的磷酸化水平。6.通过心脏灌流对小鼠的大脑进行固定包埋以便于进行冰冻切片。7.对小鼠的脑组织切片进行组织免疫荧光染色以观察小鼠脑血管发育过程中P190蛋白的表达。8.通过PCR技术鉴定P190条件性敲除小鼠的基因型。 结果:1.抑制P190功能可以导致PP2A活性下降。2威功构建GEF-H1截短质粒。将GEF-H1氨基酸片段截短为235-985和571-985。3.P190胞内段缺失后GEF-H1的571-985氨基酸片段丝氨酸的磷酸化较弱。4.胚胎期野生型C57小鼠E15.5天时P190在血管上有表达。5.C57野生型新生小鼠中，P190在血管上的表达逐渐减少。P10幼仔的大脑切片中，P190与血管的共定位开始减少，两周后仍有少量定位，25天后开始在朗飞氏节上高表达。6.构建了P190血管内皮特异性敲除小鼠。 结论:1.P190通过PP2A磷酸酶使GEF-H1发生去磷酸化，P190导致GEF-H1去磷酸化的位点存在于571-985aa片段。2.在野生型C57BL/6小鼠脑血管发育过程中，P190在脑血管上的表达逐渐降低。3.构建了血管内皮特异性敲除P190的转基因小鼠。