背景肝癌是全球范围内癌症相关死亡的第二大主要原因。肝细胞肝癌(HCC)占原发性肝癌的90%以上,绝大部分的患者处于疾病的进展期才被诊断。分子靶向药物是目前针对进展期HCC唯一有效的治疗方法,但患者的总体生存获益仍不理想。因此,目前亟待研究出针对肝癌更加有效和创新治疗方式。STUB1(STIP1同源性和包含U-box蛋白1),是包含U-box结构域的E3连接酶成员,主要参与到蛋白质内质网相关降解途径中的的泛素化过程,并通过识别蛋白质的非天然状态而充当参与内质网质量控制的伴侣分子。STUB1广泛参与到肿瘤的发生发展,增殖和侵袭等过程,然而STUB1对于肿瘤微环境的影响尚未见报道。目前,STUB1在肝癌中的作用尚不清楚。程序性死亡配体1(Programmed cell death ligand 1,PD-L1,也称为CD274)是抗原刺激活化后的T细胞表面PD-1(Programmed cell death protein 1,也称为CD279)的主要抑制性配体。PD-L1与PD-1结合后,能够限制T细胞的增殖活化,肿瘤细胞借此逃避T细胞的杀伤和清除。既往有研究报道黑色素瘤中STUB1可能是PD-L1的负性调控因子,但具体机制尚不清楚。肝癌中,STUB1对PD-L1的影响及其分子机制未见报道。目的研究STUB1在HCC癌与癌旁组织中的表达差异,并分析STUB1表达在患者长期预后判断中的作用,从而验证STUB1在HCC中作为肿瘤分子标记物的潜在价值。明确STUB1对于肝癌微环境中免疫细胞浸润的影响及其潜在作用机制。阐明STUB1对于肝癌细胞PD-L1表达的影响及其潜在的分子机制。方法采用免疫组织化学的方法检测70对HCC患者病理组织和对应癌旁组织中STUB1的表达情况,并比较STUB1在两种组织中的表达差异。分析70例HCC组织中STUB1蛋白表达水平与患者临床病理特征以及预后之间的相关性,并分析STUB1是否为HCC预后独立危险因素。构建慢病毒稳转STUB1敲低和过表达的肝癌细胞株,通过体外CCK-8实验、克隆形成实验和流式细胞术探究STUB1对肝癌细胞增殖和凋亡的影响。分别采用稳转敲低Hepa 1-6细胞和稳转过表达Hepa 1-6细胞构建小鼠肝癌原位模型,观察敲低或过表达STUB1对小鼠体内肿瘤生长的作用。通过TIMER数据库分析肝癌中STUB1表达水平与肿瘤相关巨噬细胞(TAM)、CD8+T细胞等免疫细胞浸润水平之间的相关度。随后通过免疫组织化学的方法检测70例HCC患者肿瘤组织中STUB1的表达情况以及TAM(CD163+)的浸润水平;接着采用流式细胞术分析STUB1稳转敲低Hepa 1-6细胞及其正常对照细胞构建的小鼠肝癌原位瘤中M2型TAM的浸润水平。通过转录组测序及后续的KEGG和GSEA分析,探索受STUB1调控的基因与相关信号通路,并采用ELISA实验检测Huh7细胞中STUB1对细胞上清中CSF-1的表达水平影响。通过TIMER数据库预测肝癌中STUB1 m RNA表达水平与PD-L1 m RNA表达水平之间的相关性。采用荧光定量PCR、蛋白印迹、流式细胞术分析在有或无IFN-γ刺激下,敲低STUB1对肝癌细胞PD-L1 m RNA及蛋白水平的影响。采用流式细胞术检测STUB1稳转敲低Hepa 1-6细胞及其正常对照细胞构建的小鼠原位瘤中CD8+T细胞的凋亡和耗竭情况。最后通过免疫印迹及免疫共沉淀实验探索STUB1在肝癌中对IFN-γ-JAK2-STAT3信号轴的调控及其直接作用机制。结果STUB1在肝癌中的表达水平显著低于癌旁组织中的表达水平。肝癌中STUB1的表达水平与患者的肿瘤大小、远处转移、TNM分期等临床病理指标无显著相关性,但生存分析结果显示STUB1低表达患者总体生存率劣于STUB1高表达患者,多因素Cox回归分析结果显示STUB1低表达是HCC患者术后生存预后的独立危险因素。细胞功能学实验显示,STUB1并不能在体外影响肝癌细胞的增殖和凋亡,体内实验却发现肿瘤细胞中敲低STUB1能够促进Hepa1-6细胞原位荷瘤小鼠肝癌的生长,而过表达STUB1能够抑制Hepa1-6细胞原位荷瘤小鼠肝癌的生长。通过分析肝癌患者组织标本及小鼠肝癌原位瘤中STUB1表达与TAM浸润程度相关性发现,肝癌中STUB1表达水平与微环境中M2型TAM的浸润水平呈负相关。KEGG及GSEA分析的结果提示,STUB1主要参与到细胞因子与受体交互作用的信号通路中,ELISA结果也显示STUB1能够负向调控肝癌细胞CSF-1的分泌。TIMER数据库分析发现,肝癌中STUB1的m RNA表达水平与PD-L1的m RNA表达水平呈负相关。通过体外实验发现,STUB1对肝癌细胞PD-L1 m RNA及蛋白水平的调控依赖于IFN-γ的作用;体内实验进一步发现,肿瘤细胞中敲低STUB1能够促进肝癌原位荷瘤小鼠微环境中CD8+T细胞的凋亡和耗竭。机制研究发现,STUB1可以介导IFNGR2的泛素化降解,从而抑制IFN-γ对JAK2-STAT3信号通路的激活,进而下调肿瘤细胞PD-L1的表达。结论1.相较于HCC癌旁组织,STUB1在HCC癌组织中的表达水平显著下降。STUB1低表达的HCC患者术后总体生存预后劣于高表达患者,且STUB1低表达是HCC患者术后预后的独立危险因素。2.肝癌中STUB1表达下调,促进细胞因子CSF-1的分泌从而使肿瘤微环境中M2型TAM的浸润水平增加,进而影响肿瘤的发生和发展。3.肝癌中STUB1能够介导IFNGR2的泛素化降解。当STUB1表达下调时,激活IFN-γ介导的JAK2-STAT3通路的活化,使肿瘤细胞表面PD-L1表达上调,从而抑制肿瘤微环境中CD8+T细胞的活性,最终抑制肝癌的抗肿瘤免疫。