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产气荚膜梭菌（Cp,Clostridium perfringens）常驻于人类和动物的胃肠道中,当胃肠道中的致病性产气荚膜梭菌超过某个浓度时就会引起坏死性肠炎的发生。多年来,抗生素一直被用作生长促进剂并用于控制家禽中的坏死性肠炎,但由于抗生素耐药性的出现,全世界都开始逐渐禁止使用抗生素作为饲料添加剂。随着限抗禁抗的趋势,禽坏死肠炎的发病率逐渐增加,导致养禽业损失增加。我们需要寻找抗生素替代物以控制家禽中的坏死性肠炎,噬菌体便是其中之一。本研究旨在分离禽产气荚膜梭菌并研究其耐药性,用分离到的产气荚膜梭菌感染动物,使用噬菌体进行治疗并与抗生素的治疗效果进行比较,为噬菌体代替抗生素控制家禽中的坏死性肠炎提供理论基础,为绿色养殖提供新思路。主要研究内容与结果如下:1.产气荚膜梭菌的分离鉴定（1）产气荚膜梭菌的分离纯化本研究共从湖南、湖北、山东、山西等地多个鸡场采集鸡盲肠部位样品500份,从中分离纯化出139株产气荚膜梭菌,分离率为27.8%。（2）产气荚膜梭菌的毒素及血清型检测对分离到的产气荚膜梭菌的毒素及血清型用PCR进行检测。结果显示,分离到的139株产气荚膜梭菌中113株为A型,占比81.29%,26株为G型,占比18.71%,其中具有cpb2毒素基因的有65株,约占60.75%,暂未分到C型及产cpe毒素的菌株。（3）产气荚膜梭菌的耐药性检测用测定最小抑菌浓度（MIC）的方式来测定产气荚膜梭菌的耐药性。结果显示,139株产气荚膜梭菌对大多数抗生素表现出一定的耐药性,其中对氯霉素完全耐药,对阿莫西林的耐药率达75.35%,对环丙沙星的耐药性达60.56%,对青霉素、恩诺沙星、头孢类抗生素等抗生素有较高的敏感性。139株产气荚膜梭菌对硫酸新霉素、红霉素的MIC值大于临床推荐使用剂量的达92.25%和31.70%,对安普霉素和壮观霉素的MIC值虽在临床推荐使用范围以内,但MIC具体值≥128μg/ml的比值分别为85.42%和56.25%。2.噬菌体的裂解试验使用双层平板点滴法对噬菌体的裂解率进行测定,噬菌体由武汉格瑞农公司提供,为噬菌体鸡尾酒制剂,主要成分为产气荚膜梭菌噬菌体。结果显示,此噬菌体能够裂解134株分离到的产气荚膜梭菌,裂解率高达96.4%。3.动物实验（1）产气荚膜梭菌的感染本实验选取5株G型菌株及40日龄的罗曼灰蛋鸡60只,连续灌胃1×10~9 cfu/m L的混合菌液1m L,9天后,进行随机剖检。结果显示,除对照组外各组均出现病变,十二指肠肠壁及肠系膜严重出血,空肠和盲肠均有明显鼓气,肠壁变薄,十二指肠内壁出血点密集,以上症状显示产气荚膜梭菌感染成功。（2）肠道形态学观察及病变评分治疗实验完成后对各组鸡进行解剖并观察肠道病变,结果显示,对照组肠道状况正常,攻毒组大部分肠腔内有大量气体,肠壁大量出血并有少量坏死,高剂量噬菌体治疗组、低剂量噬菌体治疗组以及抗生素治疗组肠腔内部有少数出血点,大部分少于5个出血点。根据肠道病变评分标准对各组肠道病变进行评分,结果显示,对照组评分最低,经产气荚膜梭菌攻毒后,病变评分极显著增高（P＜0.01）,经高剂量噬菌体、低剂量噬菌体及抗生素治疗后病变评分有所降低且均极显著低于攻毒组（P＜0.01）。高剂量噬菌体治疗组、低剂量噬菌体治疗组和抗生素治疗组之间无明显差异。（3）肠道组织学观察对各组十二指肠和空肠进行切片并观察其病理学变化,结果显示,攻毒组出现明显病变,十二指肠肠绒毛上皮细胞坏死脱落,空肠出现了大面积隐窝消失、炎性细胞浸润的现象,其余组的切片无明显病变。测量各组的绒毛长度和隐窝深度,数据显示,无论是十二指肠还是空肠,攻毒组的绒毛长度显著降低,经过治疗后基本恢复,攻毒组的隐窝深度明显变浅,经过治疗后均有所恢复。（4）肠道紧密连接检测使用荧光定量PCR的方法对肠道紧密连接蛋白claudin-1、claudin-2及occludin进行检测。结果显示,与对照组相比,攻毒组的十二指肠claudin-1在m RNA水平上有下调趋势,高剂量噬菌体治疗组极显著上调（P＜0.01）,与攻毒组相比,高剂量噬菌体治疗组和抗生素治疗组极显著上调（P＜0.01）,低剂量噬菌体治疗组显著上调（P＜0.05）。十二指肠claudin-2在m RNA水平上与对照组相比,抗生素治疗组极显著下调（P＜0.01）,攻毒组有上调趋势,与攻毒组相比,高剂量噬菌体治疗组和抗生素治疗组极显著下调（P＜0.01）,低剂量噬菌体治疗组显著下调（P＜0.05）。十二指肠occludin在m RNA水平上各组之间无显著差异。空肠claudin-1在m RNA水平上低剂量噬菌体治疗组相较于对照组显著上调（P＜0.05）,其余各组之间无显著差异。空肠claudin-2在m RNA水平上各组间无显著差异。空肠occludin在m RNA水平上低剂量噬菌体治疗组与攻毒组相比显著上调（P＜0.05）,其余各组之间无显著差异。（5）肠道产气荚膜梭菌检测使用荧光定量PCR的方法对各组肠道内容物的产气荚膜梭菌进行检测,结果显示,攻毒组的产气荚膜梭菌数量最多,达到10~5cfu/g,极显著高于对照组和低剂量噬菌体治疗组（P＜0.01）,显著高于高剂量噬菌体治疗组合抗生素治疗组（P＜0.05）,无论是高剂量噬菌体还是低剂量噬菌体治疗组,产气荚膜梭菌的数量均显著下降。综上所述,噬菌体无论在体内还是体外均有良好的杀灭产气荚膜梭菌的作用,动物实验结果显示,高剂量和低剂量的噬菌体均能够有效缓解产气荚膜梭菌引起的肠道损伤,其治疗效果与抗生素相当。因此,噬菌体是一种良好的抗生素替代物。