毕赤酵母异源蛋白表达系统的广泛应用基于一个高效的AOX1启动子,但该启动子的转录只响应甲醇的诱导,其他碳源如葡萄糖、果糖、甘油等,均可以阻遏AOX1启动子的转录。本研究主要分析了毕赤酵母己糖运载体编码基因PpHXT1和PpHXT2,以及碳源阻遏因子编码基因PpMIG1和PpMIG2对于毕赤酵母AOX1启动子碳源阻遏的影响。　　 本研究首先对PpHXT1和PpHXT2基因进行了功能鉴定。通过生物信息学的分析以及对酿酒酵母单糖利用缺陷菌株的回补实验证明了PpHxt1和PpHxt2确实为己糖转运载体。这两个基因的转录均受葡萄糖的严格调控:PpHXT1的表达量随着糖浓度的升高而升高,PpHXT2的表达量随着糖浓度的升高而降低。通过基因敲除菌株的构建,发现PpHxt1不仅仅是个己糖运载体,它还直接参与AOX1启动子的碳源阻遏作用。在△hxt1菌株中用果糖和葡萄糖均可以诱导AOX1启动子表达异源蛋白GFP。PpHXT2对 AOX1启动子碳源阻遏没有影响,但是研究发现它在毕赤酵母己糖代谢过程中起着关键作用,该基因的敲除使菌株在己糖中的生长明显受损,并且不能在含有呼吸连抑制剂抗霉素A的己糖培养基上生长。通过在自噬缺陷菌株△atg30中敲除PpHXT1基因,我们还阐明了在△hxt1突变株中糖诱导GFP-SKL表达量的后期下降是由于过氧化物酶体自噬所致。　　 通过简并引物PCR以及染色体走读的方法在毕赤酵母中成功获得基因PpMIG1和PpMIG2。这个两个基因所编码的蛋白质均与酿酒酵母碳源阻遏因子ScMig1同源,在氨基末端具有两个典型的C2H2锌指结构域,该结构域能够与受葡萄糖阻遏的许多基因的启动子相结合。采用双交换基因替代法,分别利用Zeocin和G418为筛选标记构建了MIG基因敲除菌株△mig1和△mig2,并用遗传杂交的方法构建了双敲除菌株△mig1△mig2。研究发现在△mig1△mig2菌株中用甘油可以诱导AOX1启动子表达外源蛋白。　　 本研究首次发现了参与毕赤酵母AOX1启动子碳源阻遏的关键因子,并利用基因工程手段成功构建了多个突变菌株,在这些菌株中AOX1启动子的转录不再依赖于甲醇而可用其他碳源来诱导,这对于开发毕赤酵母非甲醇诱导表达系统具有十分重要的意义。