【摘 要】
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围产期奶牛乳腺上皮细胞代谢旺盛,大量活性氧（ROS）生成。氧化还原平衡的破坏导致氧化应激,这是引起乳腺炎的主要原因之一。奶牛患乳腺炎后奶产量和奶品质均受到不良影响。临床上对于乳腺炎的治疗主要是应用抗生素。大量抗生素的应用会导致耐药菌产生,高产奶牛发生细菌耐药性的问题尤为严重。此外经过抗生素治疗的奶牛所产的牛奶存在抗生素残留。葛根素（Puerarin,PUE）是葛根中的一种天然黄酮类化合物,作为一种
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围产期奶牛乳腺上皮细胞代谢旺盛,大量活性氧（ROS）生成。氧化还原平衡的破坏导致氧化应激,这是引起乳腺炎的主要原因之一。奶牛患乳腺炎后奶产量和奶品质均受到不良影响。临床上对于乳腺炎的治疗主要是应用抗生素。大量抗生素的应用会导致耐药菌产生,高产奶牛发生细菌耐药性的问题尤为严重。此外经过抗生素治疗的奶牛所产的牛奶存在抗生素残留。葛根素（Puerarin,PUE）是葛根中的一种天然黄酮类化合物,作为一种潜在的抗氧化剂已引起广泛关注。然而,在牛乳腺上皮细胞中葛根素是否能起到抗炎和抗氧化应激的作用是未知的。因此,本研究的目探究葛根素对奶牛乳腺上皮细胞否有具有抗炎和抗氧化应激作用。在本研究中,首先通过体内实验探究葛根粉对牛乳腺炎的缓解作用。选取20头奶牛。正常奶牛10头,患乳腺炎奶牛10头。分为正常奶牛组、正常奶牛饲喂葛根粉组、乳腺炎奶牛组、乳腺炎奶牛饲喂葛根粉组。每组5头牛。饲喂实验一共7天。对实验奶牛饲喂葛根粉前后检测牛奶和血清中TNF-α、IL-6和IL-1β的含量。体内实验证实,饲喂葛根粉可降低乳腺炎奶牛牛奶和血清中炎症因子TNF-α、IL-6和IL-1β（P＜0.01）的含量。接下来在细胞水平进行验证葛根素是否能缓解奶牛乳腺上皮细胞的炎症和氧化应激。首先,通过H2O2处理来构建奶牛乳腺上皮细胞的氧化应激和炎症模型。通过CCK8实验检测不同浓度的H2O2（0μM、200μM、400μM、600μM、800μM和1000μM）处理细胞24 h细胞活力的影响。结果显示,牛乳腺上皮细胞在200μM和400μM H2O2的浓度细胞活力下降（P＜0.05）;600μM及更高浓度的H2O2使牛乳腺上皮细胞活力极显著下降（P＜0.01）,随后,随后选择600μM H2O2来建立奶牛乳腺上皮细胞氧化应激的炎症和模型。H2O2处理奶牛乳腺上皮细胞后活性氧（P＜0.01）,MDA（丙二醛）水平升高（P＜0.01）。T-AOC（总抗氧化能力）（P＜0.01）、SOD（超氧化物歧化酶）（P＜0.01）、CAT（过氧化氢酶）（P＜0.05）、GSH（还原型谷胱甘肽）（P＜0.01）等指标降低。荧光定量PCR（QRT-PCR）的结果显示,奶牛乳腺上皮细胞在H2O2处理下炎症因子（CCL5、IL-8、和IL-6）的m RNA表达量显著升高（P＜0.01）。在H2O2处理下血乳屏障相关基因Occludin,Symplekin,Claudin-4和ZO-1的m RNA表达水平显著降低（P＜0.01）。本研究进一步探究葛根粉的主要成分葛根素是否能减轻H2O2诱导的牛乳腺上皮细胞氧化损伤和炎症,并阐明其分子机制。将牛乳腺上皮细胞分为4个处理组:对照组、刺激组（H2O2）、挽救组（葛根素+H2O2）和葛根素组。观察各组牛乳腺上皮细胞生长情况,检测氧化应激相关指标。采用荧光定量PCR检测紧密连接基因、抗氧化基因、炎症因子的表达,Western blot检测NF-κB蛋白的表达。结果表明,葛根素处理提高了牛乳腺上皮细胞中谷胱甘肽（GSH）（P＜0.01）、过氧化氢酶（CAT）（P＜0.05）和超氧化物歧化酶（SOD）的活性（P＜0.01）,减轻了H2O2诱导的氧化应激。活性氧（P＜0.01）和丙二醛（MDA）（P＜0.01）水平降低。总抗氧化能力（T-AOC）增加（P＜0.01）。葛根素还抑制了H2O2诱导的牛乳腺上皮细胞NF-κB蛋白和相关炎症因子（IL-6和IL-8）和趋化因子CCL5的表达（P＜0.01）。葛根素处理牛乳腺上皮细胞消除了H2O2对抗氧化基因和紧密连接基因表达的抑制,增加了NRF-2、HO-1、x CT、Claudin4、Occludin、ZO-1和Symplekin的富集程度（P＜0.01）。综上所述,通过对患乳腺炎奶牛饲喂葛根粉可以降低血清和乳清中TNF-α、IL-6和IL-1β的含量。葛根素可以加强细胞间的紧密连接,降低牛乳腺上皮细胞的氧化应激,并发挥抗炎作用。本研究为葛根素缓解乳腺炎和氧化应激提供了理论依据。考虑在未来的奶牛养殖中使用葛根粉作为饲料添加剂。
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