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研究背景:糖尿病胃轻瘫(Diabitic Gastroparesis,DGP)是常见的糖尿病消化道并发症之一。尽管机体胃平滑肌的运动受神经、体液等因素的调节,但是胃平滑肌细胞本身的功能状态对平滑肌运动的影响也是不可忽略因素。胃平滑肌细胞的收缩运动是胃排空的动力来源,而有效的平滑肌细胞数量及充足的细胞能量供应则是该动力的保障。细胞凋亡能够改变有效细胞的数量,而细胞能量代谢方式的改变则能够影响细胞能量供应。如果能够发现某种因素,在高糖状态下同时影响胃平滑肌细胞凋亡与能量代谢并确定相关机制,那么对于DGP乃至糖尿病的治疗其作用都是积极的。研究发现,腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)与细胞凋亡及能量代谢关系密切。AMPK是由一个催化亚基(α-亚基)和两个调节亚基(β-亚基、γ-亚基)组成的异源三聚体,其活性表现为磷酸化AMPK。催化α亚基上的苏氨酸172位点,使其磷酸化是调节AMPK活性的关键方式。AMPK的活化主要受ADP/ATP、AMP/ATP 比率升高的影响。升高的AMP能够与AMPKy-亚基的结合位点结合,改变酶的蛋白构象,促进AMPK活化。但此种变构激活方式只能增加30-50%的酶活性,而酶的完全激活还需要上游蛋白激酶的参与,如LKB1、CaMKKβ、TAK1等。AMPK是生物能量代谢调节的关键分子,广泛存在于机体各种组织,被称为“能量感受器”。AMPK的活性可随体内不同的能量状况而改变,以此调控能量代谢。诸多研究认为,AMPK可通过影响活性氧(reactive oxygen species,ROS)、雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)、Bim、p53途径参与凋亡。至于高糖条件下AMPK参与细胞凋亡与能量代谢细胞凋亡的具体作用机制尚不明确。目的:(1)观察DGP的发生过程中,大鼠胃平滑肌细胞凋亡与能量代谢的变化及AMPK的活化及活化方式。(2)观察高糖状态下活化的AMPK对大鼠胃平滑肌细胞凋亡与能量代谢的影响。(3)观察AMPK磷酸化通路的变化,阐明AMPK活化及对细胞凋亡与能量代谢的影响机制。本研究旨在进一步阐明糖尿病胃轻瘫的发生机制,为临床探索新的治疗方案提供科学的理论依据与实验依据。材料与方法:(1)以糖尿病大鼠模型为研究对象,模型组随机分为DM4w组、DM6w与DM8w组,以正常大鼠作为对照组。分光光度计检测各组大鼠胃内色素残留率、小肠传输率及胃肠推进速率的变化,确定DGP模型建立;离体肌条实验观察DGP大鼠胃平滑肌自主收缩运动,确定运动变化情况;免疫组织化学染色结合流式细胞技术,确定各组大鼠胃平滑肌细胞凋亡情况;ELISA法检测各组大鼠大鼠胃平滑肌组织ADP、AMP、ATP的含量,计算能荷并确定能量代谢情况;Western blot观察大鼠各组大鼠胃平滑肌组织AMPK、phospho-AMPK、LKB1、CaMKKβ、TAK1的表达,确定AMPK活化情况及活化方式。(2)以体外培养的大鼠胃平滑肌细胞为研究对象,实验分为普糖组(含葡萄糖5mmol/L)、高糖组(含葡萄糖35mmol/L)、普糖+2-DG、高糖+2-DG、普糖+Compound C、高糖+Compound C。检测时间分为24h和48h。观察AMPK活化情况及加入AMPK抑制剂与激动剂后大鼠胃平滑肌细胞凋亡与能量代谢情况,确定AMPK对细胞凋亡及能量代谢的影响及条件。(3)以DGP模型大鼠与体外培养的大鼠胃平滑肌细胞为研究对象,利用磷酸化蛋白激酶抗体芯片观察DGP模型大鼠AMPK磷酸化通路的变化,确定相关差异抗体及涉及蛋白;利用RNA干扰技术沉默AMPK后,Western blot及ELISA观察高糖24h组、高糖48h组及高糖48h+siRNA组上述涉及蛋白变化,阐明AMPK活化及对细胞凋亡与能量代谢的影响机制。结果:(1)糖尿病大鼠成模后胃排空能力随病程延长逐渐减弱,成模6周胃内色素残留率增高P<0.05,小肠传输率降低P<0.01,胃肠推进速率下降P<0.05,可确定为DGP大鼠模型;DGP大鼠胃平滑肌组织自主收缩运动的频率与振幅均降低P<0.001;DGP发生过程中大鼠胃平滑肌组织存在细胞凋亡且随病程增加,成模6周P<0.05,成模8周P<0.01;DGP发生过程中大鼠胃平滑肌组织存在细胞能量代谢障碍,成模4周P<0.05,成模6周P<0.05,成模8周P<0.001;DGP发生过程中大鼠胃平滑肌组织AMPK活性成模6周被抑制P<0.05,成模8周被激活P<0.05;AMPK上游LKB1活性随病程逐渐增高,成模4周P<0.05,成模6周P<0.01,成模8周P<0.01;CaMMKβ表达随逐渐增高,成模6周P<0.05,成模8周P<0.01;TAK1活性无变化。(2)高糖状态下大鼠胃平滑肌细胞AMPK活性随时间延长增强P<0.01,但不如普糖状态下增强明显P<0.05。高糖状态下大鼠胃平滑肌细胞内游离Ca2+增多P<0.05。高糖状态下加入AMPK激动剂大鼠胃平滑肌细胞凋亡增加P<0.05;高糖状态下加入AMPK抑制剂大鼠胃平滑肌细胞凋亡下降明显P<0.01。(3)高糖初期AMPK是线粒体代谢途径的主要促进因素,但不增加该途径ATP产量,同时对糖酵解途径也具有促进作用,但只是促进糖酵解途径的因素之一;高糖晚期AMPK是线粒体途径的主要抑制因素;同时对糖酵解途径仍具有促进作用,且为主导调节因素。(4)AMPK磷酸化信号抗体蛋白芯片检测发现差异抗体73个,其中磷酸化抗体30个,去除非特异性抗体,还剩余18个磷酸化抗体;涉及p53、AKT、4E-BP1、p70S6K、CaMKⅡ、CaMKⅣ、PLC-β3、PKA、ACC1、eEF2 等因子。(5)高糖48h组p53表达增高P<0.01,AMPK干扰后表达下降P<0.01;芯片结果发现活化的AMPK能够上调p53Ser315磷酸化,及下调p53Ser392磷酸化。高糖48h组Akt活性下降P<0.001,AMPK干扰后活性上升P<0.001;芯片结果发现活化的 AMPK 能够调节 AktlSer124、Aktl SlThr246、AktTyr326、Akt Ser473 等位点的磷酸化。高糖48h组p70S6K活性下降P<0.001,AMPK干扰后活性上升P<0.001;芯片结果发现活化的AMPK能够抑制p70S6KThr389与p70S6KSer411的磷酸化。高糖48h组PKA活性升高P<0.01,AMPK干扰后略有下降,但不明显;芯片结果发现活化的AMPK能够增加PKA-R2BSer113的磷酸化。高糖48h组BAX与Caspase-3表达增高均为P<0.05,AMPK干扰后无变化;高糖48h组Bcl-2表达下降P<0.001,AMPK干扰后表达升高P<0.001。(6)高糖48h组4E-BP1表达无变化;芯片结果发现活化的AMPK能够增加 4E-BP1 Thr70与 4E-BP1 Ser65 磷酸化。(7)高糖48h组PLC-β3表达下降P<0.001,AMPK干扰后略有升高,但不明显;芯片结果发现活化的AMPK能够增高PLCβ Ser1105的磷酸化。高糖48h组CaMKⅡ活性上升P<0.001,AMPK干扰后活性下降P<0.001;芯片结果发现活化的AMPK能够增加CaMKⅡ Thr305磷酸化。高糖48h组CaMKⅣ活性上升P<0.001,AMPK干扰后活性变化不明显;芯片结果发现活化的AMPK能够增加CaMKⅣThr196/2000磷酸化。(8)高糖48h组eEF2表达增加P<0.01,AMPK干扰后eEF2表达变化不明显;芯片结果发现活化的AMPK能够下调eEF2Thr56磷酸化,上调eEF2KSer366磷酸化。高糖48h组ACC1表达增加P<0.001,AMPK干扰后ACC1表达下降P<0.01;芯片结果发现活化的AMPK能够下调ACCSer79与ACCSer80磷酸化。结论:1.在DGP发生过程中大鼠胃平滑肌存在细胞凋亡及能量代谢障碍,且AMPK被激活。2.高糖状态下活化的AMPK通过调节大鼠胃平滑肌细胞p53、Akt、p70S6K、PKA、PLC-ββ3、CaMKⅡ、CaMKⅣ及4E-BP1的表达与活性,促进细胞凋亡,且随时间延长促凋亡作用越明显。3.高糖状态下活化的AMPK通过调节大鼠胃平滑肌细胞ACC1、p53、PKA、PLC-β 3、CaMKⅡ、CaMKⅣ及eEF2的表达与活性,参与能量代谢的调节,表现为对线粒体代谢途径先促进后抑制;对糖酵解途径始终为促进作用。