研究背景：　　 全球乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染者约为20亿人，其中慢性感染者已超过3.5亿人。原发性肝癌是全世界常见的恶性肿瘤，HBV感染的慢性化被认为是主要的致病因素，但其致癌的具体机制尚不完全清楚。　　 乙型肝炎病毒X基因编码的X蛋白(hepatitis B virus X protein，HBx)是一种多功能病毒调节蛋白，具有广泛的基因转录调控作用，是HBV感染和复制过程中必须的多功能病毒蛋白质，并可能直接诱导肝细胞癌变。　　 研究表明细胞癌变与细胞周期失控密切相关，典型的细胞周期包括有严格顺序的5个期即G0(静止期)-G1期(合成前期)-S(合成期)-G2期(合成后期)-M期(分裂期)。细胞周期调控机制的核心是一组细胞周期依赖性蛋白激酶(CDKs)，受细胞周期素(cyclin)及其抑制蛋白的正负调节。其中CDK4/6与cyclin D1、D2、D3结合是G1期运行的必要条件。　　 Rb是第一个被克隆的抑癌基因，参与和调节细胞由G1向S期过渡。Rb的磷酸化状态是其调节细胞生长分化的主要形式，Rb在非磷酸化状态时可与E2F蛋白结合，并抑制其活化基因表达的功能，当处于磷酸化时则不能与E2F结合，而E2F与DP1蛋白形成的二聚体在细胞由G1期进入S期过程中起了关健作用。　　 P16亦为抑癌基因，属于周期依赖性激酶抑制因子(CDKI)基因家族，编码的p16蛋白为CDK4/6抑制剂，与CDK4/6有高度亲和性，在细胞增殖调控中与cyclin D1竞争同CDK4/6结合，对细胞周期发挥负性调控作用。通过阻止细胞周期通过G1/S检验点，在调节细胞增殖与调亡、阻止有DNA损伤的细胞进行分裂增殖中起到关键的作用，它的失活可导致细胞周期缩短，生长加快，从而诱发肿瘤。　　 研究发现，在肝癌患者的癌组织和血清标本中，可同时检测到野生型和突变型的HBV X基因，对比HBV相关HCC和HBV相关肝病患者血清和肝组织标本后发现，在HBV相关HCC中，突变型HBV X检出率更高，同时发现整合到肝细胞基因组的HBV X比未整合的HBV X突变机率高得多。据此有人推测突变型HBV X可能有其不同的生物学功能，突变型HBV X可能是肿瘤的早期事件和选择的结果。　　 研究目的：　　 1、明确氨基端或羧基端缺失突变50个氨基酸的HBx对肝癌细胞增殖的影响及可能机制。　　 2、探讨HBx促进肝癌细胞增殖的可能功能域。　　 实验方法：　　 采用PCR法扩增氨基端或羧基端缺失50个氨基酸的HBx基因片段(HBxn、HBxc)，并定向插入绿色荧光蛋白(GFP)真核表达载体pEGFP-C1的HindⅢ和KpnⅠ酶切位点，并用HindⅢ、KpnⅠ双酶切及测序鉴定已构建重组体pGFP-HBxn及pGFP-HBxc。采用脂质体转染法将重组体pEGFP-HBxn、pGFP-HBxc转染HepG2细胞，用G418筛选抗性细胞克隆，在荧光显微镜下观察GFP-HBxn、GFP-HBxc融合蛋白的表达。RT-PCR鉴定HBxn、HBxc基因的转录与表达，建立稳定表达GFP-HBxn、GFP-HBxc融合蛋白的HepG2细胞系(HepG2/GFP-HBxn、HepG2/GFP-HBxc)。以HepG2/GFP-HBxn、HepG2/GFP-HBxc及本室保存的HepG2、HepG2/GFP、HepG2/GFP-HBx细胞作为本实验体系。MTT法检测上述细胞的细胞增殖，流式细胞术检测细胞周期，Western blot法检测p16、总Rb、pRb795的表达。根据方差齐性检验结果，组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较用LSD-t检验，P＜0.05认为有统计学显著性差异。　　 实验结果：　　 经双酶切及测序鉴定表明成功构建了GFP与氨基端或羧基端缺失50个氨基酸的HBx重组表达载体pGFP-HBxn、pGFP-HBxc。将pGFP-HBxn、pGFP-HBxc，分别转染HepG2细胞，经G418筛选获得抗性细胞克隆，在荧光显微镜下见部分抗性克隆细胞表达较强的GFP荧光蛋白。将带绿色荧光蛋白的抗性克隆细胞扩大培养并传代，细胞仍表达强的荧光蛋白，RT-PCR检测示HepG2/GFP-HBxn、HepG2/GFP-HBxc细胞分别有HBxn、HBxc的转录和表达。MTT检测示HepG2/GFP-HBx、HepG2/GFP-HBxc细胞的增殖速度明显快于HepG2、HepG2/GFP、HepG2/GFP-HBxn细胞。(p＜0.05)。流式细胞术检测示HepG2/GFP-HBx(51.043±3.628)％、HepG2/GFP-HBxc(48.143±3.721)％细胞的G0/G1期百分比较HepG2(65.767±1.665)％、HepG2/GFP(65.193±2.952)％细胞明显减少(P＜0.05)，然而HepG2/GFP-HBxn(67.950±2.128)％细胞同HepG2、HepG2/GFP细胞比较无明显差异。Western blots检测结果显示HepG2/GFP-HBx、HepG2/GFP-HBxc细胞的p16、Rb表达量明显低于HepG2、HepG2/GFP细胞，然而pRb795表达水平则高于HepG2、HepG2/GFP细胞。HepG2/GFP-HBxn细胞p16、Rb、pRb795的表达水平同HepG2、HepG2/GFP细胞无差异。　　 结论：　　 1、HBx与羧基端缺失突变50个氨基酸的HBx均能促进肝癌细胞的增殖。　　 2、HBx与HBxc可能是通过抑制抑癌基因p16、Rb的表达及促进Rb的磷酸化从而调控细胞周期进而促进肝癌细胞的增殖。　　 3、氨基端缺失50个氨基酸的HBx不具有促进肝癌细胞增殖能力，而野生型HBx及羧基端缺失50个氨基酸的HBx却保有这种功能，这提示HBx的氨基端可能在调控肝癌细胞增殖过程中起更重要的作用。