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2010年以来,贵州省部分地区规模化养猪场猪群出现不同程度的腹泻,部分养猪场采用猪流行性腹泻-猪传染性胃肠炎二联灭活疫苗进行紧急免疫,但效果甚微。为弄清仔猪病毒性腹泻在贵州省的流行情况,笔者主要开展了仔猪病毒性腹泻病原快速检测方法的建立、贵州省仔猪病毒性腹泻流行病学调查及相关基因分析的研究,研究结果为贵州省仔猪病毒性腹泻的诊断、治疗和疫苗研究提供重要依据。1.PEDV、TGEV和RV RT-PCR检测方法的建立与临床应用:本研究根据Genbank提供的PEDV、TGEV和RV基因参考序列,设计三对特异性引物,以PEDV-TGEV-RV三联疫苗RNA反转录cDNA为模板,分别建立PEDV、TGEV和RV RT-PCR检测方法,并对其进行了反应条件的优化。结果显示,PEDV、TGEV和RV扩增长度分别为651bp、859bp、309bp,与预期大小相符;PEDV、TGEV和RV RT-PCR反应体系最佳退火温度均为53℃,最适引物浓度为10 nmol/μL;PEDV、TGEV和RV最低cDNA模板检出浓度分别为1.28×10-8g/L,0.36×10-7g/L,2.6×10-9 g/L,特异性、敏感性良好,能够用于临床检测。2.贵州省仔猪病毒性腹泻流行病学调查:(1)采用常规流行病学方法对贵州省部分规模化养猪场进行仔猪病毒性腹泻发病状况调查、免疫状况调查、临床症状与大体病变观察。结果表明,2013年~2014年的5个州(市)13个规模养猪场,猪群发生腹泻性疾病多在12月至翌年5月,发病率为70.35%(3020/4293),病死率为76.16%(2300/3020)。(2)用ELISA方法对贵州省2013~2014年收集的7个地州(市)20个规模养猪场184份血清样本进行PEDV、TGEV和RV抗体检测。结果显示:PEDV、TGEV和RV血清总体阳性率分别为39.13%、33.70%和42.39%;PEDV、TGEV和RV免疫抗体阳性率分别为44.05%、32.14%、46.43%;未免疫猪群PEDV、TGEV和RV抗体阳性率为35.00%、35.00%、39.00%。(3)采用RT-PCR方法对111份临床疑似病毒性腹泻样本进行PEDV、TGEV和RV病原核酸检测。结果显示:PEDV、TGEV和RV的核酸检出率分别为82.88%(92/111)、1.80%(2/111)和10.81%(12/111);PEDV与TGEV混合感染阳性率为0.02%(2/111),PEDV与RV混合感染阳性率为10.81%(12/111)。以上结果说明,我省养殖场存在PEDV、TGEV和RV隐性感染的情况。3.猪流行性腹泻病毒(PEDV)分子流行病学调查:参考GenBank登录的PEDV比利时毒株CV777株(NO.AF353511)基因序列,针对S、M和ORF3基因设计特异性引物,采用RT-PCR方法,扩增目的基因,并进行连接、转化、克隆和测序分析,并利用DNAStar、MEGA5.0软件对贵州省地方流行株S、M和ORF3的基因序列进行遗传演化分析。结果显示,本研究成功克隆6株毒株的S、M和ORF3基因,遗传变异分析如下:(1)6株贵州地方流行株S基因的全长为均为4161bp,编码1387个氨基酸,核苷酸与氨基酸同源性分别在98.0%~99.1%和97.3%~100%之间;与国内外PEDV参考毒株核苷酸同源性在91.8%~93.9%之间,氨基酸同源性在91.3%~99.3%之间。与参考毒株CV777相比,6株地方流行株S基因存在420个碱基突变,在175~186,417~419共有15个碱基的插入,在481位~486位共同缺失5个碱基。(2)6株地方流行株M基因全长均为681bp,编码226个氨基酸;核苷酸与氨基酸之间的同源性分别在99.9%~100%和97.8%~99.6%之间;与国内外的PEDV参考毒株核苷酸的同源性在97.8%~98.2%之间,氨基酸同源性在97.8%~98.2%之间。M基因的核苷酸序列出现部分点突变,无插入和缺失,氨基酸序列无变化,说明M基因保守性高。(3)6株地方流行株ORF3基因全长为675bp,编码225个氨基酸,核苷酸与氨基酸之间的同源性分别在99.0%~100%和98.2%~99.6%之间;与国内外的毒株核苷酸的同源性在96.1%~98.5%之间,氨基酸同源性在95.6%~99.1%之间。与CV777毒株序列相比,流行毒株ORF3基因存在29处点突变,无碱基的缺失和插入。进化树分析,6株流行毒株与CV777株、美国毒株和韩国毒株亲缘关系较近,与LZC、Brl/87亲缘关系较远。结论:1.本试验成功建立了PEDV、TGEV和RV的RT-PCR检测方法,敏感性高、特异性好能够用于临床诊断。2.经流行病学调查显示,贵州省部分规模养猪场存在不同程度猪病毒性腹泻感染,且主要病原为PEDV;血清学调查表明贵州省猪群腹泻疫病的免疫效果较差,存在隐性感染的情况。3.对PEDV病毒S、M和ORF3三个基因的遗传进化分析结果表明,贵州省PEDV地方流行株分为两群,与韩国毒株、越南毒株和美国毒株亲缘关系近;而与LZC、Brl/87亲缘关系远。从S和ORF3基因的遗传变异分析,推测贵州流行株为PEDV变异强毒株。