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14年来,全球转基因作物的种植带来了巨大的经济、生态和社会效益。但是,转基因作物给人类带来巨大的利益的同时也存在潜在的环境安全风险。水稻和大豆是世界上最为重要的粮食作物和经济作物,我国较早开展了抗病虫转基因大豆和水稻的研究,全面准确地评价转基因水稻和大豆的环境安全性是进行商业化种植的前提保证。本文针对转基因抗虫水稻和抗真菌病害大豆对根际微生物的影响,通过常规培养计数、DGGE分析及荧光蛋白标记等手段,研究了转基因植株对土壤微生物、转基因微生物对作物及环境微生物之间的影响,并建立了以不动杆菌为指示菌的外源基因水平转移体系,主要结果如下:1、转基因抗病大豆和转基因抗虫水稻对根际微生物群落的影响:结合传统的平板计数法和变性梯度凝胶电泳分析连续两年对田间种植的转chi + rip抗病大豆G0431、G0433及其各自的亲本非转基因大豆黑农35、吉林30和温室内种植的转cry1Ac+ sck水稻MF86及其亲本非转基因水稻明恢86的根际土壤可培养细菌(包括芽胞杆菌、荧光假单胞菌)、真菌、放线菌进行平板计数和群落结构分析。结果显示,时间变化是造成根际可培养微生物数量及土壤细菌和真菌群落结构变化的主要因素,而同一时间内转基因大豆、转基因水稻和其各自亲本对照非转基因大豆和水稻根际土壤的的可培养微生物数量以及细菌和真菌群落结构之间并无显著不同。2008年,大豆根际土壤细菌群落多样性指数为5.32-5.37,群落分布均匀度指数为0.91-0.95;大豆根际土壤真菌群落多样性指数为4.78-4.91,群落分布均匀度指数为0.81-0.89;水稻根际土壤细菌群落多样性指数为5.11-5.16,群落分布均匀度指数为0.93-0.99;水稻根际土壤真菌群落多样性指数为4.78-5.14,群落分布均匀度指数为0.66-0.95;2009年,大豆根际土壤细菌群落多样性指数为5.40-5.45,群落分布均匀度指数为0.93-0.97;大豆根际土壤真菌群落多样性指数为5.21-5.26,群落分布均匀度指数为0.96-1.00;水稻根际土壤细菌群落多样性指数为5.28-5.35,群落分布均匀度指数为0.88-0.95;水稻根际土壤真菌群落多样性指数为4.99-5.39,群落分布均匀度指数为0.67-0.98。以上结果说明几丁质酶和核糖体失活蛋白双价基因导入到大豆中以及Bt杀虫蛋白基因cry1Ac和sck双价基因导入到水稻中并没有对大豆和水稻根际可培养细菌、真菌和放线菌的数量以及细菌和真菌的群落结构产生显著影响。2、转基因水稻外源基因水平转移检测体系的建立为了明确转基因水稻中外源基因是否会向土壤微生物发生转移,建立了以目前已知自然状态下接受外源DNA能力最强的不动杆菌Acinetobacter baylyi ADP1为指示菌的外源基因水平转移检测体系。Acinetobacter baylyi ADP1能够以较强的能力将外源DNA整合到自己的基因组上,以超声波破碎处理的转基因水稻MF86的基因组片段转化Acinetobacter baylyi ADP1,对5.0×106个转化子进行PCR检测,未发现含有Bt cry基因的转化子。由此推测,转基因水稻中的外源基因不会或者只可能以低于10-6的频率能够转移到土壤微生物中去。3、苏云金芽胞杆菌工程菌发酵上清液中重组质粒的水平转移检测:Bt工程菌发酵后期,细胞裂解,重组质粒随着发酵液进入环境,这些携带外源基因的质粒能否水平转移至常见的微生物体内,对环境微生物产生不良影响是Bt工程菌环境安全评价的重要方面。经PCR和大肠杆菌热激转化检测证实重组的质粒DNA随着菌体的裂解进入到发酵上清液中。以提取自静置不同时间处理的苏云金芽胞杆菌工程菌HD73(pSTK)发酵上清液中的DNA以及相应的过滤除菌的发酵上清液分别转化不动杆菌Acinetobacter baylyi ADP1、苏云金芽胞杆菌HD73、枯草芽胞杆菌Bs168以及蜡样芽胞杆菌Bc14579的感受态细胞,未得到阳性转化子。研究结果表明:即使在人为的高浓度条件下,这些残留的重组质粒和外源基因也不会或只可能以低于10-8的频率转移到其他的环境微生物中去,从这个角度再次证明Bt工程菌对环境微生物是安全的。4、HD73(pSTK-gfp)进入水稻体内研究:为了检测Bt工程菌能否从根际进入植物体内,本文用绿色荧光蛋白标记苏云金芽胞杆菌HD73,得到了gfp标记的HD73(pSTK-gfp);在激光共聚焦显微镜下观察,在细菌生长的任何时期都产生绿色荧光。接种HD73(pSTK-gfp)于水稻幼苗根际后,结合平板计数法和激光共聚焦显微镜技术,在常规水稻植株体内没有检测到经过gfp基因标记的苏云金芽胞杆菌工程菌,说明Bt工程菌在环境中的扩散能力是有限的,从这个层面证实了它在田间的使用是安全可靠的。