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睾丸特异性蛋白酶TSP50是一种苏氨酸蛋白酶,它的异常表达在肿瘤的发生及发展过程中发挥重要作用。以往人们对TSP50的研究主要集中于其对肿瘤细胞生物学特性的影响,而关于TSP50的免疫调节作用的研究基本没有涉猎。本文拟详细探讨TSP50对巨噬细胞功能的影响,并对其机制进行初步研究。为了探讨TSP50对巨噬细胞功能的影响,我们构建了一个稳定表达TSP50的CHO细胞系,并用稳转细胞系的上清液对巨噬细胞进行处理,之后利用Real-time PCR方法检测过表达TSP50的细胞上清对巨噬细胞(THP-1以及原代小鼠腹腔巨噬细胞)分泌功能的影响。结果显示,过表达TSP50的细胞上清可以促进巨噬细胞表达炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6以及抗炎因子IL-10。然后,我们鉴定了在过表达TSP50细胞上清刺激后巨噬细胞的分化类型。我们分别检测了巨噬细胞M2b分化亚型的标志物(CCL-1和IL-10)以及M1分化亚型的标志物(CCL-5、IL-12和iNOS)的表达情况。结果显示,TSP50细胞上清上调了巨噬细胞中CCL-1和IL-10的表达量,对M1分化亚型标志物的表达没有明显的影响。随后我们利用鸡红细胞吞噬实验和酵母吞噬实验检测了巨噬细胞吞噬功能的变化。结果显示,和对照组相比,过表达TSP50的细胞上清能明显地提高巨噬细胞的吞噬能力。并且与过表达TSP50细胞共培养的巨噬细胞,其吞噬能力也明显提高。因为TSP50是一种非分泌性蛋白,为了确定在TSP50细胞上清中调控巨噬细胞功能变化的因子,我们检测了在过表达TSP50的细胞和细胞上清中细胞因子的表达情况。结果显示,TNF-α、IL-1β、IL-6、TGF-β和VEGF的表达量均发生了上调,其中TNF-α上调的幅度最明显。为了确定细胞上清对巨噬细胞功能的影响是否是由TNF-α引起的,我们构建了TNF-α的干涉载体,并转染到过表达TSP50的CHO细胞中。在确认了干涉载体的效果之后,我们用干涉TNF-α的TSP50过表达细胞上清刺激巨噬细胞。结果显示,IL-1β、IL-10和TGF-β的表达被抑制,而IL-6的表达量基本不变;并且CCL-1、IL-10和CCL-5的表达量下降;巨噬细胞的吞噬能力亦明显下降。相反,在巨噬细胞的培养上清中加入40 ng/m L的TNF-α重组蛋白,可以明显地提高巨噬细胞分泌细胞因子的能力,增加CCL-1的表达量和巨噬细胞的吞噬能力。以上结果说明,TSP50通过其诱导的TNF-α的表达调控了巨噬细胞的功能。之后我们验证了过表达TSP50诱导产生的IL-1β是否对巨噬细胞的功能有影响。我们构建了IL-1β的干涉载体,并验证了其干涉效率。我们用敲低IL-1β的TSP50过表达细胞上清刺激巨噬细胞,并检测巨噬细胞内其它细胞因子mRNA表达的变化。结果发现IL-1β、TNF-α和IL-10的表达显著降低,而IL-12、iNOS和CCL-5的表达有所增加。对这些因子蛋白表达水平的分析也显示出了同样的趋势。最后,我们用20 ng/ml IL-1β重组蛋白刺激巨噬细胞,发现TNF-α、IL-6、IL-10、CCL-5和CCL-1的表达均被上调。我们进一步分析了TSP50调节巨噬细胞免疫功能的胞内信号转导机制。我们利用过表达TSP50的细胞上清处理巨噬细胞,分别在15分钟和30分钟时检测NF-κB信号通路的活性。结果显示,用过表达TSP50的细胞上清处理后,巨噬细胞内p-IKKα/β的表达水平显著提高,并且p65的入核显著增加。这说明TSP50激活了巨噬细胞中的NF-κB信号通路。为了确定TSP50的细胞上清是否通过TNF-α激活巨噬细胞的NF-κB信号通路,我们用干涉了TNF-α的TSP50细胞上清刺激巨噬细胞。结果发现,p-IKKα/β和p-IκBα的水平均下降,而TNF-α重组蛋白则能增加巨噬细胞内p-IKKα/β和p-IκBα的水平。之后我们利用NF-κB信号通路的抑制剂PDTC对巨噬细胞进行预处理后,加入过表达TSP50的细胞上清进行刺激,然后检测巨噬细胞的细胞因子分泌功能、分化表型和吞噬功能。结果显示,当NF-κB信号通路被抑制时,过表达TSP50的细胞上清原本对巨噬细胞细胞因子分泌功能和吞噬功能的促进作用均被抑制,巨噬细胞内CCL-1的表达量减少。以上结果提示,过表达TSP50的细胞上清可通过激活NF-κB信号途径促进部分炎症因子及抗炎症因子的表达,增强巨噬细胞的吞噬功能,并促使巨噬细胞向M2b亚型进行分化。体内成瘤实验显示,TSP50诱导的肿瘤组织内浸润了大量的巨噬细胞,并且微环境中富含大量的TNF-α、IL-1β、IL-6、TGF-β、CCL-5和CCL-1。我们通过CD11b和F4/80两种表面标志物分选出肿瘤组织中的巨噬细胞,并检测对照组和实验组巨噬细胞中细胞因子与分化标志物的表达情况。结果显示,实验组巨噬细胞中IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-12、iNOS、IL-10、CCL-5和CCL-1的表达均被上调。本研究证实,原癌基因TSP50参与调控了肿瘤微环境中巨噬细胞的功能,这为我们研究癌基因与机体免疫功能之间的关系奠定了一定的理论基础。