慢性肾脏病(chronic kidney disease,CKD)的发病率在我国及世界范围内逐年递增,给众多患者增加经济、精神负担的同时也给公共卫生事业带来了巨大问题。CKD是指肾脏结构或功能异常>3个月的疾病,其诊断标准包括:(1)白蛋白尿[AER≥30 mg/24 h;ACR≥30mg/g(或≥3mg/mmol)];(2)尿沉渣异常;(3)肾小管相关病变;(4)组织学异常;(5)影像学所见结构异常;(6)肾移植病史,肾小球滤过率(GFR)下降[eGFR<60 mL/(min·1.73m2)],任何一项指标异常持续时间超过3个月即可确诊。2012年我国有关于CKD流行病学调查结果显示:成年人CKD患病率为10.8%,并预估已有成年慢性肾脏病患者1.2亿,而其知晓率仅为12.5%。肾阳虚证候要素包括温煦失职、腰府失养、髓海空虚、生殖减退、水液泛滥、阳虚水泛、冲气上逆、冲任不调等多种特征。中医认为慢性肾脏病可归于(水肿、关格、腰痛)等病证范畴,且在临床诊疗中对本病虚证所采用的治法方药与肾阳虚证关系密切。慢性肾脏病病位主要在肾,病变发展与肾阳虚证密切相关,本虚标实为其基本病机,虚、瘀、浊、毒贯穿于疾病始终,相互影响、相互发展。以此为基础,现代中医药工作者针对二者的内在联系进行了较多的临床研究,如慢性肾脏病病理改变与中医辩证分期的对应关系、中医证候在慢性肾脏病中分布规律等方面。由此,以临床中医证候规范化要素为基础,构建慢性肾脏病肾阳虚证大鼠模型是基础实验研究最适合的介质,并对相关模型筛选评价具有重要意义。本次研究以SD雄性大鼠为实验对象,采用尾静脉注射盐酸阿霉素,联合羟基脲药物因素诱导大鼠成模,并以真武汤干预药物反证,且对其宏观行为学、生物指标等进行检测,进而对本类模型作出较为客观的评价以及真武汤对本类模型的可能干预机制进行一定的研究阐释。目的:1.探索应用盐酸阿霉素联合羟基脲诱导建立慢性肾脏病肾阳虚证动物模型的具体方法,为慢性肾脏病肾阳虚证的实验和药学研究提供较为标准的中医病证结合动物模型。2.探索总结与中医理论相合的慢性肾脏病肾阳虚证大鼠模型评价体系,包括症状体征、客观指标确立、药物反证等,并将真武汤对本类模型可能干预机制进行阐释,为慢性肾脏病肾阳虚证辨证标准系统化研究奠定一定生物学基础。方法:1.慢性肾脏病“肾阳虚”证大鼠模型的建立采用盐酸阿霉素尾静脉注射建立CKD大鼠模型,并复合羟基脲灌胃构建CKD肾阳虚证大鼠模型。使用SPF级6～8周龄SD雄性大鼠64只,喂食普通饲料。其中选取48只大鼠隔周分两次进行尾静脉注射阿霉素(3mg/kg、4mg/kg),并检测大鼠24h尿蛋白≥50mg,即为诱导慢性肾脏病动物模型成功。以尿蛋白和体重为依据将造模成功的SD雄性大鼠,使用分层随机方法分为正常组、阿霉素组、阿霉素羟基脲组、真武汤组分别灌胃给药。记录实验大鼠体征状态,体质量称重,收集大鼠24小时尿液,检测24h尿蛋白含量。各组大鼠于第26周股动脉取血,分离血清后测定各项指标。将大鼠肾脏、脾脏、睾丸称重,计算肾重/体重比、脾脏、睾丸指数。2.肾脏石蜡包埋、切片,使用HE、Masson染色,分析大鼠肾脏病理学变化;3.比色法:检测大鼠血清 AST、ALT、UA、UREA、TP、ALB、TC、TG 和 SOD 含量。4.酶联免疫法:检测大鼠血清T3、T4、TSH、FSH、LH、T、E2含量。5.实验数据使用SPSS 23.0进行统计分析。结果:1.CKD大鼠模型的建立与评价经阿霉素诱导后,实验第4周,SD大鼠逐渐出现双下肢水肿,毛色暗淡、光泽度降低;模型组大鼠24h尿蛋白于实验第5周起高于正常组大鼠(P<0.05);模型组大鼠于实验第7、9、11周24h尿蛋白定量显著高于正常组(P<0.011),且≥50mg确认为模型成功。2.CKD肾阳虚证大鼠模型的建立与评价2.1一般情况实验第12周左右,大鼠出现阳虚类症状,如脱毛、弓背、懒动、蜷缩,部分大鼠体型较为瘦弱、行动迟缓。2.2 24h尿蛋白定量实验第12周,CKD肾阳虚证大鼠24h尿蛋白量统计结果显示:阿霉素组、阿霉素羟基脲组尿蛋白显著高于正常组(P<0.01);阿霉素羟基脲组显著高于真武汤组(P<0.01)。实验第16、20、24周,CKD肾阳虚证大鼠24h尿蛋白定量统计结果均显示各组趋势与12周时相似。2.3体质量变化复合因素作用于大鼠后,体重呈现一定变化趋势。实验第12周,阿霉素组、阿霉素羟基脲组体重显著低于正常组(P<0.01);阿霉素羟基脲组体重低于真武汤组(P<0.05)。实验第15周,阿霉素组及阿霉素羟基脲组体重显著低于正常组(P<0.01);实验第18、21、23、26周,较前实验节点相似,阿霉素组、阿霉素羟基脲组及真武汤组体重显著低于正常组(P<0.01)。2.4游泳实验实验第16周,正常组大鼠平均游泳时间最长,与正常组相比,阿霉素组、阿霉素羟基脲组有显著差异(P<0.01);实验第20、24周各组大鼠游泳时间趋势与第16周相似。2.5红外测温红外测温是通过红外感应动物体表红外线辐射后,反应为一定的数字温度。红外热成像通过红外采集镜头将动物体表辐射红外线接收后,以不同色阶标识从低温到高温不同温度,进而把动物表面不可见的热场信息与分布以人眼可见的图像显示,通过观察和分析所采集对象的色阶分布所代表的红外辐射轨迹进行定性评价,近年来有较多研究应用这两项技术对动物模型的阳虚程度作出评判。经测温后,CKD肾阳虚证大鼠左前爪温度统计结果显示:与真武汤组比较,阿霉素羟基脲组统计学差异不明显,但在平均数值水平具有一定趋势。CKD肾阳虚证大鼠尾根部温度统计结果显示:与正常组相比,阿霉素组及阿霉素羟基脲组温度有显著差异(P<0.01)。选取大鼠鼻尖、上下肢、尾根部及左右肾脏投影区作为红外热成像检测位点,鼻尖部位中,阿霉素羟基脲组与阿霉素组相比,有显著差异(P<0.01);左上肢中,阿霉素羟基脲组与正常组相比,有显著差异(P<0.01);左下肢、右上肢、右下肢各组比较没有统计学意义;尾根部及左右肾投影区,各组比较没有统计学意义。2.6 CKD肾阳虚证大鼠肾脏病理变化大鼠肾脏组织HE、Masson染色结果显示阿霉素组、阿霉素羟基脲组大鼠相较于正常组而言肾小球系膜区变宽,系膜细胞呈现不同程度增生,病变累及的肾小球处部分肾小管上皮细胞发生空泡样变,肾间质有大量炎性细胞浸润。真武汤组肾小球系膜细胞轻度增生,肾间质有少量炎性细胞浸润。3.真武汤对CKD肾阳虚证大鼠模型干预机制研究3.1肾重体重比及脏器指数实验第26周取材后,阿霉素组大鼠肾重体重比平均值水平高于正常组;阿霉素羟基脲组大鼠肾重体重比高于正常组(P<0.05)。各组脾脏指数比较未有统计学差异;阿霉素羟基脲组、真武汤组大鼠睾丸外观相较于正常组及阿霉素组明显缩小,且和正常组、阿霉素组相比,大鼠睾丸指数显著降低(P<0.01)。3.2血清学指标1)肝功能AST:阿霉素组、阿霉素羟基脲组与正常组相比,统计学差异不显著,但各组间平均值水平有一定趋势;ALT:与正常组、真武汤组相比,阿霉素组有显著差异(P<0.01)。2)肾功能Scr:各组间比较没有统计学差异;UA:真武汤组与正常组相比,有统计学差异(P<0.05);BUN:真武汤组显著低于阿霉素组(P<0.01)。3)血脂及白蛋白TC:各组间无统计学差异,但阿霉素组、阿霉素羟基脲组、真武汤组均值水平高于正常组,其中真武汤组水平低于阿霉素羟基脲组。TG:阿霉素组高于正常组(P<0.05),阿霉素羟基脲组、真武汤组均值水平高于正常组。TP、ALB:阿霉素组、阿霉素羟基脲组、真武汤组均值均低于正常组,其中真武汤组与正常组有统计学差异(P<0.05)。4)甲状腺激素T3:阿霉素羟基脲组、真武汤组显著低于正常组(P<0.01),阿霉素羟基脲组、真武汤组显著低于阿霉素组(P<0 01);T4:阿霉素组、阿霉素羟基脲组、真武汤组较正常组显著降低(P<0.01);真武汤组较阿霉素羟基脲组水平显著升高(P<0.01);TSH:阿霉素组、阿霉素羟基脲组、真武汤组较正常组显著升高(P<0.01);真武汤组相较阿霉素羟基脲组显著升高(P<0.01)。5)性腺激素T:各组均值水平具有趋势性,阿霉素羟基脲组、真武汤组低于正常组,真武汤组均值高于阿霉素羟基脲组;E2:阿霉素组水平较正常组显著降低(P<0.01);阿霉素羟基脲组水平低于正常组(P<0.05);阿霉素羟基脲组高于阿霉素组(P<0.05);真武汤组水平相较于阿霉素组显著升高(P<0.01);FSH:阿霉素组、阿霉素羟基脲组、真武汤组水平较正常组显著降低(P<0.01);真武汤组高于阿霉素羟基脲组(P<0.05);LH:阿霉素组、阿霉素羟基脲组、真武汤组水平较正常组相比显著降低(P<0.01);真武汤组相较于阿霉素组显著升高(P<0.01)。6)超氧化物歧化酶与正常组相比,阿霉素组、阿霉素羟基脲组、真武汤组有显著差异(P<0.01);真武汤组相较于阿霉素组显著升高(P<0.01);真武汤组显著高于阿霉素羟基脲组(P<0.01)。7)cAmp、cGmpcAmp:阿霉素羟基脲组水平较于正常组显著升高(P<0.01);真武汤组相较于正常组升高(P<0.05),其余组间无差异;cGmp:阿霉素羟基脲组相较于正常组升高(P<0.05);真武汤组相较于阿霉素组升高(P<0.05),其余组间无差异;cAmp/cGmp:各组间比较无统计学差异。结论:1.通过分次尾静脉注射盐酸阿霉素(3mg/kg、4mg/kg)复合羟基脲(375mg/kg)剂量可以成功诱导大鼠CKD肾阳虚证模型;2.通过模型一般情况、耐力变化、代谢能力各项评价性实验检测CKD肾阳虚证大鼠模型的稳定性,阿霉素羟基脲组大鼠表现与临床辨证中的主要症状较为符合,对本次实验诱导模型是否确立具有佐证作用;3.成模后的阿霉素羟基脲组大鼠甲状腺、性腺等器官功能处于抑制状态,而真武汤作为药物反证组和干预因素,结果表明真武汤组表现优于模型组。说明真武汤对于阿霉素联合羟基脲诱导CKD肾阳虚证大鼠模型具有治疗作用,也佐证了本次建立模型的科学可行性。