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多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)是一种能以甲醇为唯一碳源和能源的酵母菌,属于甲基营养性酵母菌.近年来,不论在基础理论研究还是在生产应用方面均取得了很大的发展.多形汉逊酵母作为多种外源基因表达的受体菌,需要较多种类的筛选标记.同时为筛选有利于外源基因在多形汉逊酵母中高效表达的受体菌,本研究采用化学诱变的方法筛选出所需的多种营养缺陷型突变株.本研究采用多形汉逊酵母HP-1为出发菌株,使用化学诱变剂硫酸二乙酯(DES)进行诱变.通过优化诱变剂的作用时间及浓度,寻找到较为合适的诱变条件.采用制霉菌素富集培养的方法,以增加诱变后突变株所占的比例.经过大量的筛选,共获得ura缺陷型12株,leu缺陷型8株,ade缺陷型16株及52株甲醇氧化酶突变株.对筛选出的营养缺陷型的生物量、遗传稳定性进行测定,获得2株ura、4株ade、4株leu生物量较高、遗传稳定的营养缺陷型.为筛选突变位点发生在甲醇氧化酶基因的甲醇氧化酶缺陷型,根据已知的甲醇氧化酶(MOX)基因序列,利用PCR方法,扩增出亲株HP-1的甲醇氧化酶基因片段.将扩增出的MOX基因片段、多形汉逊酵母自主复制序列(HARS)、载体YEP352重组,构建重组质粒pHAM-1.将重组质粒pHAM-1转化筛选出的52株甲醇氧化酶突变株,通过重组质粒所携带甲醇氧化酶基因的表达互补,筛选出恢复甲醇利用能力的转化子.共获得7株在甲醇氧化酶基因位点突变的甲醇氧化酶缺陷型突变株.