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三聚氰胺（melamine，MEL）属于食品和饲料中的非法添加物，并且它可以从环境或食品包装材料等途径导致食品和饲料的污染。MEL具有一定的细胞毒性、急性毒性、慢性毒性和致敏性，人和动物体长期摄入MEL会对泌尿、生殖系统造成损伤，对此很多国家都设立了食品和饲料中MEL的限量标准。所以，开发相应的MEL检测方法就非常重要和必要。与很多仪器分析方法相比，酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）分析法因具有检测低成本、快速、灵敏、适用于现场检测等优点而被广泛应用于MEL的检测，而合成MEL完全抗原并用其免疫实验动物以制备出高效价、高灵敏度和特异性强的抗体是建立ELISA方法的重要前提。 为了合成优质的MEL抗原并探求便捷有效的MEL完全抗原合成方法及抗原鉴定方法，以用于MEL的ELISA试剂盒研发，本研究合成了一种MEL衍生物，并用其与载体蛋白偶联以制备MEL人工完全抗原，通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）和紫外光谱（ultraviolet spectrum，UV）法对完全抗原进行了鉴定，同时对UV检测条件进行了优化；之后采用两种MEL完全抗原分别免疫两组BALB/c小鼠，通过ELISA方法对抗血清的效价、灵敏度和特异性进行了评价，具体研究内容与结果如下： 1.MEL衍生物DTBA的合成与鉴定 通过MEL的结构类似物2-氯-4,6-二氨基-1,3,5-三嗪（2-chloro-4,6-diamino-1,3,5-triazine，CDAT）与γ-氨基丁酸（gamma-aminobutyric acid，GABA）反应合成了MEL的衍生物4-亚氨基-（4,6-二氨基-1,3,5-三嗪）丁酸（4-(4,6-diamino-1,3,5-triazin-ylamino)butanoic acid，DTBA），通过高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）法、质谱（mass spectrometry，MS）法和UV法和红外光谱（infrared spectrum，IR）法对DTBA进行了分析鉴定，结果表明：在参照国家标准GB/T22400—2008中检测MEL的类似色谱条件下，MEL、CDAT和DTBA的保留时间分别为5.408min、1.730min和4.364min；一级质谱、二级质谱和三级质谱中给出的分子量信息和结构信息都证明DTBA合成成功；DTBA在212nm处和237nm处有特征紫外吸收峰，与MEL的紫外吸收光谱类似；而DTBA的红外光谱特征吸收峰在12.8μm（781.57cm-1）和2.99μm（3348.85cm-1）处。 2.MEL人工完全抗原的合成与鉴定 采用碳二亚胺（carbodiimide，CDI）法将 DTBA分别与牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、阳离子牛血清白蛋白（cationized BSA，cBSA）、卵清蛋白（ovalbumin，OVA）和多聚赖氨酸（polylysine，PLP）偶联，合成了DTBA-BSA、DTBA-cBSA、DTBA-OVA和DTBA-PLP四种MEL人工完全抗原，通过SDS-PAGE法和UV法对MEL完全抗原进行了分析鉴定。其中，SDS-PAGE难以区分出DTBA-BSA、DTBA-OVA和DTBA-PLP与其各自载体蛋白对照的差别，而对UV法的扫描条件进行优化后则能够通过紫外光谱图对四种MEL完全抗原进行鉴定，证明人工完全抗原合成成功。 3.抗MEL抗血清的制备及其性质分析 以DTBA-BSA和DTBA-cBSA作为免疫抗原，分别免疫两组BALB/c小鼠，每组3只，免疫剂量均为100μg/只（以蛋白质含量计算），首次免疫间隔时间为21d，后续各次免疫间隔时间为14d，分别在首次免疫后第10d以及后续各次免疫后第7d分别对小鼠采血、收集血清。通过ELISA方法对抗体产生进程、抗血清效价、灵敏度及特异性进行了评价，结果表明：6只BALB/c小鼠经3次免疫后都能够对抗原产生的免疫应答，免疫应答水平总体趋势一致，不同小鼠的免疫应答存在着一定个体差异；当采用DTBA-OVA为包被抗原时，6只小鼠的抗血清效价可以达到1.28×104至1.024×105，效价较高；当采用DTBA-PLP作为包被抗原时，抗血清效价介于2×102至6.4×103之间，效价较低；间接竞争ELISA实验中，竞争抗原MEL和DTBA对6只小鼠抗血清的竞争抑制率均在90％以上，说明抗血清对MEL和DTBA没有灵敏度。此后，通过抗血清的特异性实验对没有灵敏度的原因进行了分析，结果表明很可能是因为免疫抗原中DTBA与载体蛋白的偶联摩尔比较低、没有诱发小鼠产生针对DTBA的特异性抗体所致。