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目的HCN通道功能改变在SAH早期脑损伤中扮演极其重要的角色,HCN通道功能下调所致的神经元兴奋性紊乱将直接加重神经元的损伤,并可能最终导致SAH后继发性神经功能损害的发生。本实验目的为:1.观察大鼠模型蛛网膜下腔出血(SAH)后早期脑内超极化激活-环核昔酸门控的阳离子(HCN)通道的表达变化。2.评估HCN通道功能变化在SAH后早期脑损伤发生中的作用。方法1.动物模型的建立及分组:选取雄性Wistar大鼠(270~300g),制作大鼠线栓穿刺法SAH模型,并分为4组,分别为假手术组(sham组);蛛网膜下腔出血组(SAH组);注射HCN通道阻断剂组;注射HCN通道非特异性激动剂组;每组5只大鼠。2.侧脑室微注射HCN通道抑制和增强剂:后两组于造模成功3h内分别向侧脑室微量注射ZD7288(10mM,5μl)和NO/Sp(10mM,5μl),速度0.25μl/min。3.神经功能评价及:于造模成功后24h,应用改良Garcia评分系统对各组大鼠行神经功能评分。4.SAH出血分级:大鼠处死后取完整脑组织行SAH出血评分。5.细胞凋亡检测:应用TUNEL/NeuN免疫荧光双标检测各组大鼠SAH后24h时海马和前额叶皮层(mPFC)的神经元凋亡情况。6.谷氨酸含量检测:应用谷氨酸专用酶联反应试剂盒(Glutamate Assay Kit,Abcam)检测各组大鼠脑脊(CSF)液中谷氨酸(Glu)含量变化。结果1.神经功能评价:与sham组相比,大鼠SAH后24h神经功能损害显著,HCN通道表达下调,给予侧脑室注射HCN通道阻断剂(ZD7288)后进一步加重大鼠SAH后的神经功能损害,而给予非特异HCN通道激动剂(No/Sp)后并未改善大鼠SAH后的神经功能损害。2.细胞凋亡检测:大鼠SAH后24h海马及前额叶皮层出现神经元凋亡,尤以海马为著;给予侧脑室注射ZD7288后进一步加重上述两脑区神经元凋亡情况,而给予No/Sp后并未能显著缓解神经元凋亡情况。3.脑脊液中谷氨酸含量检测:大鼠SAH后24h脑脊液中谷氨酸(Glu)含量显著增加,给予侧脑室注射ZD7288脑脊液中谷氨酸(Glu)含量进一步增加;给予No/Sp后并未能显著影响脑脊液中谷氨酸(Glu)含量变化。结论蛛网膜下腔出血(SAH)是一种破坏性疾病,发病率高,死亡率高。由于缺乏有效的治疗,SAH后患者的生存率很低,即便存活下来,生活质量也大大下降。目前对于SAH后早期脑损伤的研究主要集中在两个方面,一是脑血管痉挛,二是HCN通道功能改变。但是,针对血管痉挛的治疗有效的例子屈指可数。因此,HCN通道在SAH后早期脑损伤中的作用就显得尤为重要。本实验可以得出如下结论:1.HCN通道在SAH后早期脑损伤中发挥重要作用,SAH后HCN通道功能下调是导致神经元兴奋性紊乱发生的重要环节,进而可能直接加重了SAH后的早期脑损伤,阻断HCN通道后,神经元损伤及神经功能损害进一步加重;2.SAH后早期给予HCN通道非特异性激动剂(No/Sp)干预后并未显著改善SAH后早期神经元损伤及神经功能损害情况。还需要进一步实验验证。