海洋生物具有同陆地生物相同的蛋白酶组分,其中?-淀粉酶是众多蛋白酶中最重要胞外蛋白酶,它广泛存在于植物、动物、微生物等多种生物群体中。?-淀粉酶在生物体碳水化合物代谢过程中起到至关重要的作用,且有研究表明?-淀粉酶与生物体生长具有显著相关性。因此本研究对九孔鲍(Haliotis diversicolor supertexta)?-淀粉酶基因cDNA全长进行克隆,分析九孔鲍中?-淀粉酶的理化性质,并对?-淀粉酶基因组织表达模式进行探究。在研究?-淀粉酶基因结构的基础上,笔者对?-淀粉酶基因中的SNP位点进行筛选,分析得到与九孔鲍生长相关的SNP位点,并对位点进行分型及多态性研究。最后笔者采用实时荧光定量研究了盐度、胁迫时间2个非生物因子对九孔鲍?-淀粉酶基因表达量进行差异分析,为九孔鲍生长差异提供分子方面的理论依据。研究结果具体如下:1.九孔鲍?-淀粉酶基因cDNA全长克隆及组织表达实验采用cDNA末端快速扩增(RACE)和反转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术对九孔鲍?-淀粉酶基因cDNA进行克隆,结果表明,?-淀粉酶基因cDNA全长为2260bp,其中开放阅读框长度为2088bp,5’UTR长68bp,3’UTR长104bp,共编码氨基酸695个。经SingalP该多肽含有信号肽结构,且信号肽由18个氨基酸组成(M1WAQYGIVSALLVLSASA18),表明该蛋白为分泌蛋白。对α-淀粉酶进行结构域分析发现,该蛋白含有2个结构域(domainA、domainC),在domainA中含有淀粉酶催化中心,位于第28~396氨基酸处。对九孔鲍α-淀粉酶进行同源性分析发现,九孔鲍与皱纹盘鲍淀粉酶序列同源性最高达87.9%,而与山羊、人类等脊椎动物淀粉酶序列同源性较低(<50%),表明九孔鲍α-淀粉酶与无脊椎动物同源性高,与脊椎α-淀粉酶同源性低。构建系统进化树显示,九孔鲍?-淀粉酶基因与无脊椎动聚为一簇,且与皱纹盘鲍的亲缘关系最近。相较而言,九孔鲍?-淀粉酶基因与人类、野猪、小鼠以及硬骨鱼类的亲缘关系较远。采用实时荧光定量PCR技术对九孔鲍α-淀粉酶的组织表达特征进行分析,结果表明α-淀粉酶在九孔鲍右侧壳肌、肠、消化腺、胃、外套膜、吻、腹足7种组织中均不同程度表达。其中α-淀粉酶基因在九孔鲍胃、消化腺、肠组织中为高水平表达,且胃中表达量高达326.803;相反右侧壳肌、外套膜、吻、腹足中α-淀粉酶基因低水平表达,外套膜中表达量仅为0.35。经ANOVA分析可知,消化组织与非消化组织间的α-淀粉酶基因表达量存在显著差异(P<0.05)2.九孔鲍?-淀粉酶基因SNP位点筛选及生长相关性研究对九孔鲍?-淀粉酶基因中间片段采用直接测序法进行SNP筛选,共获得2个与生长相关的SNP位点,经过分析,其中一个SNP位点位于淀粉酶基因cDNA全长中第1174bp处,且发生CG突变(g.1174C>G),而另一个SNP位点位于1488bp处发生CT突变(g.1488C>T)。通过对SNP位点进行基因型统计分析,1174bp位点存在3种基因型,分别为CC、GG和CG,而1488bp位点也同样存在3种基因型,分别为CC、TT、CT。对SNP位点进行遗传多样性性参数分析,结果表明,g.1174C>G期望杂合度为0.4997,观测杂合度为0.6129;g.1488C>T期望杂合度为0.4745,观测杂合度为0.4516。且2个SNP位点均符合哈迪-温伯格平衡(P>0.05)。根据位点的多态性信息含量(PIC)可知,家系的平均多态性为0.3669,表明家系淀粉酶基因间多态性较低。经过九孔鲍?-淀粉酶基因型与生长性状相关性分析,以上2个SNP位点均与九孔鲍生长性状显著相关(P<0.05),且g.1174C>G处基因型为GG的个体在体重和壳长方面显著高于基因型为GC和CC的个体(P<0.05),表明C为显性性状,G为隐性性状;g.1488C>T处基因型为TT的个体在体重、壳长以及壳宽等方面均显著低于基因型为CC和CT的个体,表明C为显性性状而T为隐性性状。因此可以推测出含有C的个体生长性状优良。3.盐度及胁迫时间对九孔鲍?-淀粉酶基因表达联合效应采用中心复合设计和响应曲面法,以盐度和胁迫时间作为变量对九孔鲍?-淀粉酶基因表达进行联合效应分析。结果表明,盐度对九孔鲍?-淀粉酶基因表达量的一次效应影响不显著(P>0.05),而胁迫时间对淀粉酶基因表达量影响的一次效应显著(P<0.05),表明盐度对九孔鲍?-淀粉酶基因表达量的影响是非线性的,而胁迫时间对九孔鲍?-淀粉酶基因表达量的影响是呈线性关系。分析发现盐度的二次效应显著(P<0.05),胁迫时间二次效应不显著(P>0.05),表明盐度对九孔鲍?-淀粉酶基因表达量的影响呈现曲线效应,即随盐度升高,淀粉酶基因表达量呈现先上升后下降的峰值变化。相反胁迫时间对九孔鲍?-淀粉酶基因表达量的影响呈非曲线效应。此外盐度和胁迫时间之间不存在交互作用,即两个因子为独立因子,彼此间互不影响。实验建立的?-淀粉酶基因表达回归模型达极显著水平(P<0.05),且失拟项不显著(P>0.05),表明实验拟合出的方程有效。且回归方程的决定系数为80.05%,校正系数65.80%,预测系数50.18%,表明方程拟合度较好,模型选择较为恰当,可以为不同盐度和胁迫时间诱导下的淀粉酶基因表达量变化提供参考依据。