趋化因子是具有多种生物学功能的小分子生物活性肽家族,相对分子量为8～10KD,由组织细胞的生长因子,炎性细胞的细胞因子和致病刺激物诱导产生。趋化因子能够引起细胞的定向迁移,在肿瘤的发生、发展中起重要作用。趋化因子能够引起肿瘤细胞的扩散,淋巴细胞对肿瘤的浸润和肿瘤的血管发生。趋化因子的命名是由趋化性细胞因子衍生的。这些机能相关的小分泌蛋白构成的大家族迄今发现的成员已逾60个,都具有高度保守的氨基端半胱氨酸(Cysteine,C)残基。趋化因子在结构特征上具有保守的蛋白结构,称为趋化因子支架(Chemokine Scaffold),由两个保守的二硫键链接的半胱氨酸残基组成。依其分子结构中靠近氨基端的最初两个半胱氨酸残基排列顺序,趋化因子蛋白被分为4个高保守的亚家族：CXC族、CC族、C族、CX3C族,其中以CXC和CC族趋化因子种类居多。VCC-1是新发现的趋化因子,位于染色体的19q13.2,属于趋化因子家族,能够对肿瘤演进的未知领域进行预测。这一基因的蛋白产物编码119个氨基酸,前22个氨基酸构成信号肽,蛋白含有6个半胱氨酸残基,其中4个残基分别位于2个CXC结构域中,目前列为CXCL趋化因子17。研究发现在乳腺癌、结肠癌、肾癌、肺癌中VEGF的表达上调与这一基因密切相关。在内皮细胞的血管形成时期该基因的表达上调。高表达该基因的NIH3T3细胞移植到裸鼠中的能迅速成瘤,而注射接种空载体的NIH3T3细胞的对照组没有瘤形成。Northen Blot方法研究发现该基因的表达水平在乳腺癌、结肠癌中升高。VCC-1基因编码的蛋白具有IL-8样趋化因子的蛋白折叠结构,与趋化因子CXCL8和CXCL14的结构和功能类似,能够诱导单核细胞和未成熟树突状细胞迁移。该蛋白的免疫组化研究表明VCC-1在肺组织中有组成型表达,提示VCC-1蛋白的潜在作用是诱导单核细胞和树突状细胞从血液进入肺实质。肿瘤的生长和转移是一个复杂的、连续的、多阶段的过程,并表现出高度的组织特异性,非任意性和器官选择性。能够生长和转移到特定器官的恶性肿瘤细胞均具有多种机制促进它们侵袭组织和增强生长繁殖能力,包括增强它们粘附到器官微血管内皮细胞的能力、对靶器官释放的趋化因子呈高反应状态等,而靶器官必须拥有适当的趋化因子才能使肿瘤细胞成功地进入,并生长繁殖。在早期研究中发现,许多恶性肿瘤,如结肠癌、肺癌、乳癌和肾癌等,都有宿主免疫细胞的侵润,主要是单个核细胞系细胞,进一步研究发现了能特异性诱导单个核细胞定向迁移的“肿瘤源性趋化因子”,并发现肿瘤源性趋化因子的产生与肿瘤组织中巨噬细胞的含量有关。趋化因子及趋化因子受体是引起细胞致瘤转化的遗传突变作用的下游；趋化因子及其受体也参与组成慢性炎症,这类慢性炎症容易转化为癌。趋化因子及趋化因子受体组成的趋化因子系统,会影响一个细胞的自发的或非自发的进行性肿瘤的多重通路。临床研究显示趋化因子系统是有效的标靶是新的治疗策略的标靶。趋化因子及其受体构成一个信号因子超家族,能够对肿瘤演进的未知领域进行预测。肝癌IL-8表达水平与肝癌血管侵袭相关。IL-8.MCP-1、MIP-1α与恶性肿瘤的病程进展、预后相关,是反映恶性肿瘤发生发展、生物学行为和预后的重要标记物。肿瘤细胞的凋亡、细胞周期的进展与其生长、化学治疗的敏感性存在着密切联系。肿瘤的体外实验是进行肿瘤基础研究的一种重要方法,在肿瘤的分子生物学和分子病理学研究方面发挥不可替代的作用。尽管体外环境和体内环境不完全相同,但由于肿瘤细胞株具有体内肿瘤细胞的大部分生理病理特征,因而体外细胞实验与人体肿瘤有很好的相关性,可以动态观察肿瘤细胞的生长、侵袭、转移等过程；长期传代可以观察肿瘤的遗传学行为；可以进行抗癌药物的快速筛选,便于进行抗癌剂、致癌剂和诱变剂等多方面研究。VCC-1作为一个与VEGF相关的趋化因子,研究显示其在血管形成中扮演了重要角色,而且可能在一些组织的肿瘤发生及免疫调节中具有重要作用。目前国内外对于这个新基因的相关研究报道还很少,还有很多疑问没有解决。比如,能否将它命名为癌基因；它在肿瘤中发挥什么作用以及怎么样作用；能否作为肿瘤的诊断、预后指标等等。真核细胞可以提供重组的哺乳动物基因一个仿真的环境,使得基因产物更接近自然状态,更有利于研究其生理功能,一些源于真核细胞的基因只有在真核细胞中的表达产物才有特定的生理活性,基于此,我们以该基因对肝癌细胞系生物学影响为切入点,将VCC-1片段克隆入真核表达载体,转染肝癌细胞系HepG2和SMMC-7721细胞,观察这一基因对肿瘤细胞增殖、侵袭及凋亡的影响,并且利用siRNA技术,在癌细胞中抑制VCC-1蛋白的表达,观察干涉后细胞生物学特性的改变,从多个角度对假设的功能进行进一步了解和验证。最终了解本基因编码蛋白的生物学功能,并初步探讨其发挥作用的机制,从而为全面研究VCC-1的功能及在肿瘤中的分子作用机制提供新的思路和重要实验依据,探讨该蛋白可否对肝癌的诊断、治疗及预后提供一定的信息,可否成为新的靶标。本课题在上述研究框架内,重点阐述癌组织中VCC-1表达及其与临床病理特性的相关性；VCC-1表达改变对肝癌细胞细胞增殖、迁移和凋亡的影响；探索VCC-1表达在肝癌凋亡改变的分子机制。研究内容及方法1.肝细胞癌患者癌组织、癌旁组织中VCC-1表达检测采用免疫组化技术检测临床诊断明确的肝细胞癌患者癌组织和癌旁组织中VCC-1蛋白表达水平的差异,并检测不同病理学分期肝细胞癌患者癌组织中VCC-1蛋白表达差异。同时检测临床常见恶性肿瘤患者癌组织和癌旁组织中VCC-1蛋白表达水平的差异。采用商品化的VCC-1单克隆抗体对肿瘤进行免疫组化染色,实验设置无关抗体对照和PBS对照,染色结果经有经验的病理科医生在不知随访结果条件下分别对各项指标进行光镜下观察,对免疫组织化学染色结果进行评价。2.上调VCC-1基因对肝癌细胞凋亡的影响。2.1采用用脂质体法将重组质粒pcDNA3.1-VCC-1分别转染入肝癌细胞系HepG2和SMMC-7721,采用RT-PCR、Western Blot及免疫荧光染色,对VCC-1基因的表达改变进行分析以及VCC-1蛋白在细胞内表达定位。2.2采用MTT法检测转染过表达载体后细胞的增殖情况,绘制生长曲线,未转染的细胞及转染相应空载体的细胞做为对照；采用transwell小室法观察上调VCC-1基因对肝癌细胞侵袭的影响。2.3采用流式细胞术检测不同浓度顺铂作用下的细胞凋亡,计算细胞凋亡率,与未转染的细胞及转染相应空载体的细胞相比较；在形态水平鉴定各组细胞的凋亡改变。2.4采用Western Blotting技术观察上调VCC-1基因对人肝癌细胞在顺铂诱导条件下,凋亡相关蛋白表达水平的差异性。3.下调VCC-1基因的相关实验3.1采用脂质体法将重组质粒pGPU6/GFP/Neo-shVCC-1转染人肝癌细胞系HepG2和SMMC-7721,采用RT-PCR、Western Blot及免疫荧光染色,对VCC-1基因的表达改变进行分析。3.2采用MTT法检测转染过表达载体后细胞的增殖情况,绘制生长曲线,未转染的细胞及转染相应空载体的细胞做为对照；采用transwell小室法观察VCC-1在肝癌细胞转移方面的效应。3.3采用流式细胞术检测不同浓度顺铂作用下的细胞凋亡,计算细胞凋亡率,与未转染的细胞及转染相应空载体的细胞相比较；在形态水平鉴定各组细胞的凋亡改变。3.4采用Western Blotting技术观察下调VCC-1基因的人肝癌细胞在顺铂诱导条件下,凋亡相关蛋白表达水平的差异性。结果：1.VCC-1蛋白在肿瘤组织肿瘤组织中的表达1.1肝癌组织、肝癌癌旁组织VCC-1表达差异免疫组化分析结果显示,在Ⅰ期肝细胞癌患者组织样本中,有100%(5/5)癌组织VCC-1蛋白表达水平高于其癌旁组织(n＝3,下同)；Ⅰ-Ⅱ期有100%(5/5)患者癌组织VCC-1蛋白表达水平高于其癌旁组织；在Ⅱ期有85%(73/86)患者癌组织VCC-1水平高于其癌旁组织；Ⅱ-Ⅲ期有68%(15/22)患者癌组织VCC-1水平高于其癌旁组织；Ⅲ期有87%(26/30)患者癌组织VCC-1水平高于其癌旁组织。1.2其他肿瘤组织中VCC-1表达差异免疫组化分析结果显示,在结肠癌、乳腺癌、肺癌、胃癌、胰腺癌、膀胱癌、宫颈癌患者组织样本中VCC-1水平高于其癌旁组织,在淋巴瘤患者组织样本中VCC-1不表达。2.过表达VCC-1蛋白对肝癌细胞凋亡的影响2.1过表达载体转入细胞株后的RT-PCR检测肝癌细胞的RT-PCR检测显示pcDNA3.1-VCC-1表达载体成功转入细胞内。以GAPDH为参照对电泳图进行灰度分析,发现转染VCC-1表达载体的HepG2细胞灰度值显著升高(F=10.958, P=0.032)和SMMC-7721细胞灰度值显著升高(F=119.828,P=0.000)；2.2表达载体转入细胞株后的Western-Blot检测肝癌细胞在转染pcDNA3.1-VCC-1表达载体后,以GAPDH为参照,显示HepG2细胞内VCC-1蛋白表达量比空白细胞显著升高(t=2.871,P=0.045), SMMC-7721细胞内VCC-1蛋白表达量比空白细胞显著升高(t=8.046,P=0.001)。2.3免疫荧光检测VCC-1蛋白表达免疫荧光结果显示,肝癌细胞中VCC-1蛋白均呈胞浆表达,并有向细胞膜富集的趋势,分析荧光强度显示转染VCC-1表达载体的HepG2和SMMC-7721细胞荧光强度显著高于空白对照组(P<0.05)。2.4VCC-1促进肝癌细胞生长及转移的效应MTT增殖实验研究结果表明,肝癌细胞转染pcDNA3.1-VCC-1表达载体后,统计学分析显示过表达VCC-1可以促进肝癌细胞生长(P<0.05)。Transwell小室研究结果表明,上调VCC-1具有促进肝癌细胞转移的作用。2.5VCC-1抗肝癌细胞凋亡的效应及机理性研究采用顺铂诱导人肝癌细胞HepG2和SMMC-7721凋亡,使用流式细胞术和DAPI荧光染色及电镜形态学观察检测细胞凋亡,结果显示转染过表达质粒的肝癌细胞与对照组相比,不同药物浓度下的细胞凋亡率明显下降(P<0.05)。在凋亡过程中PARP, Bcl-xL, Mcl-1,表达下降。3.下调VCC-1基因对肝癌细胞凋亡的影响3.1细胞株下调VCC-1基因的RT-PCR检测肝癌细胞的RT-PCR检测显示pGPU6/GFP/Neo-shVCC-1干扰载体成功转入细胞内。以GAPDH为参照对电泳图进行灰度分析,发现转染VCC-1表达载体细胞的灰度值下降,具有显著差异(P<0.001)。3.2干扰载体转入细胞株后的Western-Blot检测和免疫荧光检测肝癌细胞在转染pGPU6/GFP/Neo-shVCC-1干扰载体后,以GAPDH为参照,显示细胞内VCC-1蛋白表达量比空白细胞下降,具有显著差异(P<0.05)。共聚焦显微镜观察肝癌细胞中VCC-1蛋白免疫荧光染色,结果显示转染干扰载体的肝癌细胞荧光强度明显低于空白对照组,显示细胞内VCC-1蛋白表达下降,具有显著差异(P<0.05)。3.3VCC-1促进肝癌细胞生长及转移的效应MTT增殖实验研究结果表明,肝癌细胞转染干扰载体后,可以促使肝癌细胞生长率下降,数据有统计学差异(P<0.05)。Transwell小室研究结果表明,下调VCC-1具有降低肝癌细胞转移的作用,数据有统计学差异(P<0.05)。3.4VCC-1抗肝癌细胞凋亡的效应及机理性研究采用顺铂诱导人肝癌细胞HepG2和SMMC-7721凋亡,使用流式细胞术和DAPI荧光染色及电镜形态学观察检测细胞凋亡,结果显示转染过表达质粒的肝癌细胞与对照组相比,凋亡率明显升高,数据有统计学差异(P<0.05)。在凋亡过程中PARP, Bcl-xL, Mcl-1,表达升高。结论：明确VCC-1蛋白在肝细胞癌患者癌组织及癌旁组织中的差异表达及不同病理学分期肝细胞癌患者癌组织中VCC-1蛋白表达水平的差异性：一定比例的患者其癌组织中VCC-1蛋白水平高于癌旁组织,癌组织中VCC-1蛋白水平随病理学分期的严重性呈现一定相关性。明确VCC-1蛋白在常见恶性肿瘤患者癌组织及癌旁组织中的差异表达,除淋巴瘤组织外,本研究使用的结肠癌、乳腺癌、肺癌、胃癌、胰腺癌、膀胱癌和宫颈癌组织样本的VCC-1蛋白均呈阳性表达。明确肝癌细胞过表达VCC-1蛋白有助于肿瘤细胞生长并具有保护肿瘤细胞使其免于受到凋亡诱导剂对其产生的凋亡诱导作用,过表达VCC-1蛋白可促进肝癌细胞迁移。成功利用RNA干扰技术构建VCC-1蛋白低表达肝癌细胞,明确细胞内VCC-1蛋白对肿瘤细胞的生长起到一定的调节作用并影响肿瘤细胞在体外的侵袭转移。明确对于肝细胞癌发生具有重要生物学作用的VCC-1蛋白主要定位于细胞浆,VCC-1基因是一个与肿瘤形成相关的趋化因子,过表达这一基因能够增强肝癌细胞耐受化疗药物诱导的凋亡；干扰VCC-1基因表达能够促进顺铂引起的肝癌细胞凋亡。从而为肿瘤的防治提供了新的思路和干预靶点,为更深入的机制研究奠定了良好基础。