研究目的： 血管生长因子基因转染是目前缺血性心脏病治疗研究的一个新热点。目前这方面的研究主要集中于血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factors、VEGFs)基因等，并已证实它们具有促进缺血心肌血管新生的作用。但是，人酸性成纤维细胞生长因子(acidic fibroblast growth factor、aFGF、FGF-1)基因是否能够促进慢性缺血心肌再血管化尚未见报道。所以本实验将构建携带aFGF基因的复制缺陷型腺病毒载体Ad.aFGF，在体外研究证明其能够有效转染心肌细胞，高效表达aFGF蛋白质，并对血管内皮细胞和平滑肌细胞具有促增殖、分化作用的基础上，直接注射到猪慢性缺血心肌考察其促进血管生长、增加血流灌注、改善心功能的作用。 方法： 1．携带aFGF基因的腺病毒粘粒载体(pAxcAwt／aFGF)的构建 抽提胎脑组织mRNA，经RT-PCR合成aFGF基因，继而再将其插入带有腺病毒基因组的粘粒载体pAxcAwt，扩增后挑选插入方向正确的克隆。 2．aFGF基因重组腺病毒载体(Ad.aFGF)的构建 应用磷酸钙共沉淀法及DNA-TPC制备重组腺病毒，将酶切鉴定为正确的病毒克隆进一步扩增、纯化和测定滴度。同时对其使用的安全性进行评价。 3．Ad.aFGF体外转染心肌细胞及其对血管内皮细胞和平滑肌细胞的促增殖作用 分离培养胎鼠心肌细胞(FCMs)，以不同MOI值的Ad.aFGF转染FCMs，应用免疫荧光染色标记被转染的细胞，测定转染效率。以Northern杂交和Western杂交分别检测Ad.aFGF转染FCMs后aFGF mRNA的转录及aFGF蛋白的表达，以ELISA检测aFGF的分泌。用MTT法测定Ad.aFGF转染人脐静脉内皮细胞(HUVECs)和牛主动脉平滑肌细胞(BASMCs)后，aFGF对HUVECs和BASMCs的促增殖作用。此外我们还考察了Ad.aFGF是否能够在体外诱导HUVECs的分化。 4．Ad.aFGF转染慢性缺血心肌促进侧支血管增生的作用 用Ameroid环缩窄左回旋支，建立猪慢性心肌缺血动物模型。分3组进行实验：组Ⅰ注射Ad.aFGF(n=9)，组Ⅱ注射Ad.Null(缺陷型空病毒)(n=9)，组Ⅲ注射PBS(n=8)；组Ⅰ为实验组，组Ⅱ、组Ⅲ为对照组。注药后28天左右心脏彩超测定局部和整体心功能的改善；体外冠状动脉造影观察侧支血管的增生；SPECT检测缺血区血 第二翼区大学脉士学位论x0文打昙 胸叱外补专此f 流灌注的恢复；组织病理学观察心肌缺血、炎症程度，抗aFGF抗体免疫组化染色检测 aFGF在心肌组织中的表达，凝血Vlll因子相关抗原抗体兔疫组化染色考察组织中血管密 度的增加。 一： 1．提取的RNA完整、纯度高，RT－PCR合成的DNA片段经克隆、测序后确证为 目的基因一aFGF基因，插人粘粒载体pAXCAwt后筛选插入方向正确的克隆用于扩 增。＠ 一 二．建立了稳定、有效的重组腺病毒构建方法，扩增纯化后重组腺病毒滴度高达 旷十，体外使用安全。 3．原代培养获得了高纯度的胎鼠心肌细胞（FCMS）、人脐静脉内皮细胞（HUVECS） 和牛主动脉平滑肌细胞（BASMCs）。在 MOI值为 100时，Ad．aFGF转染心肌细胞的 效率高于 90％：心肌细胞转染Ad．aFGF后刀小时Northern和 Western显示细胞内有 aFGF mRNA的转录和 aFGF的表达；ELISA显示细胞培养上清中有 aFGF分泌，并至 少持续到转染后的第8天；对照组均为阴性。MTT结果表明aFGF促进HUVECs和＠BASMCS的增殖，与对照组相比统计学差异非常显著。转染了Ad．aFGF的HUVECS 生长于细胞外基质（Mat吨el MatriX）上时，出现分化，细胞相互连接成毛细血管网络 样结构，说明Ad．aFGF能在体外条件下诱导HUVECs的分化，刺激血管新生。 4．建立了稳定的大动物慢性心肌缺血模型。放置Ameroid环后4周，DSA显示 LCX完全闭塞。注药后4周，实验组体外冠脉造影显示有明显的侧支血管增生，心脏 彩超显示心功能有显著改善，SPECT显示缺血区血流灌注增加，均与对照组形成鲜明 对比。病理学显示实验组心肌仅有轻度炎症反应，与对照组无明显差别；免疫组化显 示实验组心肌内有大量aFGF表达，并持续到转染后的4周左右，对照组未见aFGF的 表达：皿因子相关抗原抗体兔疫组化染色后血管密度比较显示实验组较对照组心肌内 ＠—————。。—————一 一 有显著的血管新生。 一 1．DNA末端蛋白复合物可使重组腺病毒的制备效率大大提高，降低野生型腺病 毒出现的概率。重组腺病毒滴度高、纯度好、毒性低。 2．我们构建的携带aFGF基因的腺病毒载体，能高效转染培养的心肌细胞、血管 －3· ． 审二翼旺大掌悍士出位论又