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为研究水牛BMP-15与GDF-9基因在卵泡发生过程中的表达模式,本研究克隆了BMP-15与GDF-9基因调控序列并进行了细胞水平的表达验证。参照牛的BMP-15与GDF-9基因组序列设计多对引物,以本地水牛基因组DNA为模板,使用PCR的方法获取不同长度的水牛BMP-15和GDF-9基因调控序列片段,经测序正确后插入pEGFP-1载体,构建EGFP报告载体,用于转染不同组织源细胞,以检测调控序列的活性及组织特异性表达情况,结果总结如下：1.克隆获得了水牛BMP-15基因5’调控序列。克隆的序列为4.6kb,包括了BMP-15基因翻译起始位点上游2.8kb和下游1.8kb,序列比对显示翻译起始位点上游序列与黄牛相应序列相似性为98%。为研究不同区段的启动基因转录活性,我们对调控序列进行了分段克隆,获得包括B4.6、BTLB2.9、B1.6和B1.3五个片段,分别构建pBMP-15-EGFP-1表达载体,分别转染不同类型的细胞,显示只有BTL(-2788～+219)具有明显的启动基因转录活性,在羊促性腺激素释放细胞(LBT2)、水牛卵丘颗粒细胞(BCG)、中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、人卵巢癌细胞(SKOV3)中启动绿色荧光蛋白表达,而在水牛胎儿成纤维细胞和猪胎儿成纤维细胞中无启动EGFP转录的活性。2.克隆获得了水牛GDF-9基因5’调控序列。克隆的序列为3.7kb,包括了GDF-9翻译起始位点上游2.3kb和下游1.4kb,序列同源性比对显示翻译起始位点上游序列与黄牛相应序列相似性高达98%。同样,为研究不同区段的启动基因转录活性,我们对调控序列进行了分段克隆,获得G3.7、GTL、G2.7、G1.1和G1.21五个片段,并分别构建pGDF-9-EGFP-1表达载体,转染不同类型的细胞显示只有GTL(-2230～+89)具有明显的启动基因转录活性,在LβT2细胞、水牛卵丘颗粒细胞、CHO细胞、SKOV3细胞中启动绿色荧光蛋白表达,而在水牛胎儿成纤维细胞和猪胎儿成纤维细胞中无启动EGFP转录的活性。上述结果表明,水牛BMP-15和GDF-9的基因启动活性区域分别位于BTL(-2788～+219)和GTL(-2230～+89)片段内,获得的两片段均可以启动EGFP在LβT2细胞、水牛卵丘颗粒细胞、CHO细胞和SKOV3细胞中的表达,而不能启动EGFP在水牛胎儿成纤维细胞和猪胎儿成纤维细胞中的表达,推测两段调控序列可能为组织细胞特异性启动子。