研究目的:皮肤作为机体与外界环境的主要交界区域,具有独特的区域免疫特性。组织定居性记忆性T细胞(tissue resident memory T cells,T_RM)作为皮肤中一种特殊的T细胞亚群,在许多自身免疫性皮肤病（如白癜风）的产生、复发过程中起到重要的作用,但其参与疾病的具体机制和迁移过程尚不明确。黑素瘤分化抗原-1（melanoma-associated antigen recognized by T cells,MART-1）是黑素细胞分化抗原之一,临床研究发现白癜风患者的外周血含有很高比例的MART-1特异性T细胞,提示这些细胞与疾病的发生密切相关。部分健康人体内也存在较高比例的MART-1特异性T细胞,但不对皮肤中的黑素细胞产生杀伤作用,提示这些细胞在正常情况下处于免疫耐受状态。为了研究皮肤区域免疫特性及免疫耐受机制,建立理想的疾病动物模型是有力的研究手段。但由于小鼠与人类皮肤存在解剖层次、细胞构成等诸多方面的差别,传统小鼠模型不能作为理想的研究平台。因此,本研究以最接近人体生理、病理学特征的人源化小鼠为基础,通过移植同源人皮肤,构建皮肤-免疫系统人源化小鼠模型（skin/thy/HSCs humanized mice,STH hu-mice）,研究皮肤区域基础免疫学特性;并构建HLA-A2限制性MART-1特异性TCR转基因人源化小鼠（MART-1-TCR tg hu-mice）,通过模拟皮肤局部免疫耐受打破的过程,诱导白癜风的发生,探究特异性T_RM的免疫特性。研究方法:（1）将胚胎皮肤用含0.5mol/L海藻糖的组织冻存液进行超低温液氮冻存,复苏后移植给NOD.Cg-Prkdc^scidIl2rg^tm1Wjl（NCG）小鼠,观察移植后皮肤的发育过程,利用组织病理、免疫组化技术鉴定移植皮肤是否具有完整组织结构,研究其局部免疫细胞构成、黑素细胞的数量及分布情况。（2）NCG小鼠经过1.75Gy亚致死剂量辐照后,移植同源胸腺（肾被膜下）、胎肝来源CD34⁺造血干细胞（尾静脉）、人皮肤组织（小鼠背部）,构建STH人源化小鼠,定期检测小鼠外周血人免疫系统重建情况,第18周对小鼠进行处死取材,流式细胞术、组织病理及免疫组化技术检测小鼠皮肤、外周血、脾脏、骨髓、移植的人皮肤和胸腺中免疫系统重建情况及皮肤中免疫细胞分布情况。（3）NCG小鼠经过1.75Gy亚致死剂量辐照后,移植同源的HLA-A2⁺胸腺、HLA-A2限制性MART-1-TCR慢病毒体外感染后的胎肝来源CD34⁺造血干细胞、人皮肤组织,构建MART-1-TCR tg人源化小鼠,定期检测小鼠外周血人免疫系统重建情况和MART-1特异性T细胞表达情况,第16周对小鼠进行处死取材,流式细胞术检测小鼠皮肤、外周血、脾脏、骨髓、移植的人皮肤和胸腺中免疫细胞重建情况,皮肤中T_RM及MART-1特异性T细胞表达情况。（4）再次构建MART-1-TCR tg人源化小鼠,定期检测小鼠外周血人免疫系统重建情况和MART-1特异性T细胞表达情况,16周时对部分小鼠进行处死取材,流式细胞术检测小鼠皮肤、外周血、脾脏、骨髓、移植的人皮肤和胸腺中免疫细胞重建情况,皮肤中T_RM及MART-1特异性T细胞表达情况。其余小鼠分为3组,分别用a)MART-1抗原肽+咪喹莫特,b)DMSO+咪喹莫特,c)DMSO对移植皮肤进行局部涂抹处理,每周1次,连续处理4周,每周检测外周血中MART-1特异性T细胞的活化情况,并于第5周处死小鼠取材,流式检测上述细胞的表达,免疫组化鉴定黑素细胞的破坏情况。研究结果:（1）组织病理显示,在海藻糖的保护作用下,超低温液氮冻存的胚胎皮肤移植给NCG小鼠后,其组织结构与健康成人一致,移植的胚胎头部皮肤6-7周后可见新生黑色毛发,并持续生长。免疫组化结果显示未移植胚胎皮肤中CD45⁺细胞数量很少,主要分布于真皮;移植后15周皮肤中免疫细胞分布和数量情况较未移植胚胎皮肤无明显变化。（2）STH人源化小鼠移植人皮肤中人CD45⁺细胞浸润显著高于小鼠皮肤,其中大部分为CD3⁺T细胞,少量CD11c⁺树突状细胞（dendritic cells,DCs）,极少CD19⁺B细胞浸润。与小鼠皮肤、外周血、脾脏相比,移植人皮肤中检测到高比例的CD4⁺CD69⁺CD103^-T_RM、CD4⁺CD69⁺CD103⁺T_RM、CD8⁺CD69⁺CD103⁺T_RM。（3）MART-1-TCR tg人源化小鼠外周血、脾脏等组织检测到不同水平MART-1特异性T细胞表达,在区域免疫耐受不被打破的情况下它们绝大多数为na?ve表型,不能进入移植中皮肤中。（4）MART-1-TCR tg人源化小鼠外周血、脾脏等组织检测到MART-1特异性T细胞高水平表达;未经局部处理时,移植皮肤中未检测到MART-1特异性T细胞;咪喹莫特或咪喹莫特联合抗原肽连续处理后,区域免疫耐受被打破,移植皮肤中均有不同水平MART-1特异性T细胞浸润;MART-1免疫组化染色结果显示,只有皮肤中MART-1特异性T细胞数量最高的2只小鼠的移植皮肤真表皮交界处观察到MART-1⁺黑素细胞减少现象,模型有待进一步优化。非人源化的皮肤-NCG小鼠局部反复涂抹咪喹莫特不能导致皮肤黑素细胞破坏。研究结论:（1）胚胎皮肤在海藻糖的保护作用下经过液氮冻存,复苏后移植可存活并发育成熟,且对黑素细胞的发育无影响。（2）STH人源化小鼠移植人皮肤中免疫细胞的组成与健康成人皮肤相似,人T_RM能且仅能在移植的人皮肤组织中形成,是用于研究皮肤区域免疫、T_RM形成机制和迁移过程的理想模型。（3）在皮肤局部免疫耐受不被打破的状态下,MART-1-TCR tg人源化小鼠循环中的MART-1特异性T细胞处于未活化状态,不能进入皮肤中对靶细胞产生杀伤作用。（4）当皮肤区域免疫耐受被打破时,MART-1-TCR tg小鼠循环中的MART-1特异性T细胞能够活化并进入移植人皮肤及小鼠皮肤,但仅能在人皮肤中形成特异性定居表型。当MART-1特异性T细胞的比例达到一定水平时,能对黑素细胞产生杀伤作用。综上所述,本课题为描述皮肤区域免疫、研究T_RM在自身免疫性皮肤疾病中的形成机制和迁移过程,提供了最接近人体生理、病理学特征的理想模型,对于皮肤区域免疫学的拓展更新、免疫治疗新靶点的研发、推进皮肤区域免疫学发现的转化应用都具有重要意义。