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研究目的使用IL-35基因修饰的间充质干细胞(Mesenchymal stromal cells,MSCs)与CD4~+T细胞体外共培养,探索IL-35基因修饰的MSCs(IL-35-MSCs)在体外对CD4~+T细胞的调节作用是否依赖分泌型IL-35,并探究IL-35-MSCs是否通过c-Abl途径发挥调节作用。研究方法1.本课题第一部分,使用胶原酶消化法从小鼠腹股沟脂肪组织中提取原代MSCs,通过流式细胞术(FCM)对MSCs表面标记物进行鉴定,使用过表达IL-35基因的慢病毒载体在合适的慢病毒感染复数(MOI)下对MSCs进行转染实现MSC的基因修饰,通过荧光成像、FCM,鉴定转染效率,通过酶联免疫吸附实验(ELISA)检测细胞培养上清中分泌型IL-35的表达量。然后,应用嘌呤霉素进行筛选,对阳性克隆进行传代培养,由此获得高纯度稳定表达IL-35的MSCs(IL-35-MSCs)。2.本课题第二部分,使用磁珠分选法分离C57BL/6J小鼠脾脏来源淋巴细胞,在体外培养环境中,与基因修饰的MSCs或者对照组细胞进行共培养,具体分组如下:(1)IL-35-MSCs组,IL-35-MSCs与CD4~+T细胞共培养;(2)IL-35中和抗体组,IL-35-MSCs与CD4~+T细胞,同时加入IL-35中和抗体进行阻断;(3)MSCs对照组,未转染的MSCs与CD4~+T细胞共培养;(4)空白对照组,单纯CD4~+T细胞。共培养72h后,FCM检测共培养体系中CD4~+T细胞的Ki67表达水平判断CD4~+T细胞的增殖情况;FCM检测CD4~+CD25~+Foxp3~+Treg细胞的比例,判断CD4~+T细胞向Treg方向分化情况;ELISA法测定各共培养体系上清中细胞因子IL-10、IL-17A的表达水平,判断CD4~+T细胞的细胞因子分泌功能;qRT-PCR检测共培养体系中CD4~+T细胞IL-10与IL-17Am RNA的表达水平;蛋白质免疫印迹法(Western Blot)检测各组中CD4~+T淋巴细胞c-Abl的表达情况,探索IL-35-MSCs调控CD4~+T细胞功能及分化的信号通路。研究结果1.从小鼠脂肪中成功分离提纯出MSCs并进行增殖传代,MSCs表面高表达CD29、CD44、SCA-1,低表达或不表达CD34、CD45。采用过表达IL-35基因的慢病毒(在MOI=100的条件下)转染MSCs后,72小时后转染效率可达84.5%,慢病毒转染72小时后IL-35-MSCs组中IL-35表达量为406.7±6.615 pg/ml,MSCs组未检测到IL-35,IL-35-MSCs组分泌IL-35的量较MSCs明显增加(P<0.001)。经过嘌呤霉素药筛后成功获得稳定表达IL-35的IL-35-MSCs。2.在MSCs与CD4~+T细胞体外共培养实验中,IL-35-MSCs组和IL-35中和抗体阻断组中细胞因子IL-10和IL-17A表达水平无显著性差异,其中,两组IL-10水平均显著高于MSCs对照组和空白对照组,而IL-17A表达水平均显著低于MSCs对照组和空白对照组。IL-35-MSCs与CD4~+T细胞共培养组Ki67的表达水平显著低于MSCs对照组和空白对照组(P<0.05),而CD4~+CD25~+Foxp3~+Treg的比例则显著升高(P<0.05),提示IL-35-MSCs与单纯的MSC相比具有更强的抑制CD4~+T细胞增殖、促进其向CD4~+CD25~+Foxp3~+Treg方向分化的能力。IL-35中和抗体组Ki67的表达水平也显著低于MSCs对照组和空白对照组,但是与IL-35-MSCs组相比明显升高(P<0.05),提示IL-35-MSCs对CD4~+T细胞增殖的抑制作用可以被IL-35中和抗体部分阻断。IL-35中和抗体组CD4~+CD25~+Foxp3~+Treg的比例显著高于MSCs对照组和空白对照组,但是与IL-35-MSCs组相比明显降低(P<0.05),提示IL-35-MSCs诱导CD4~+T细胞向CD4~+CD25~+Foxp3~+Treg方向分化的作用也可以被IL-35中和抗体部分阻断。免疫印迹实验结果显示IL-35-MSCs组c-Abl蛋白表达水平显著高于MSCs对照组和空白对照组(P<0.05),而IL-35中和抗体阻断组c-Abl蛋白表达水平较IL-35-MSCs组相比明显降低(P<0.05),但是仍显著高于MSCs对照组和空白对照组(P<0.05)。结论在此研究中,首先成功构建IL-35基因修饰的MSCs,并应用嘌呤霉素筛选稳定表达的细胞株。将IL-35-MSCs与小鼠脾脏来源的CD4~+T细胞共培养,证实IL-35-MSCs相比未修饰的MSCs免疫抑制能力明显增强,促进CD4~+T细胞表达更多的免疫抑制因子IL-10,更低水平的炎症因子IL-17A;同时,IL-35-MSCs能更强地抑制CD4~+T细胞的增殖,并促进其向Treg分化。采用IL-35中和抗体阻断分泌型IL-35后,IL-35-MSC在抑制CD4~+T细胞增殖以及促进其向CD4~+CD25~+Foxp3~+Treg分化的能力被部分抑制,提示IL-35-MSCs可能还存在不依赖分泌型IL-35的途径发挥免疫调节作用,但其发挥作用具体的机制尚不明确,有待于进一步的研究。另外,在与IL-35-MSCs共培养的CD4~+T细胞中检测到更高表达的c-Abl蛋白,并且IL-35中和抗体阻断后c-Abl蛋白表达水平显著降低,说明IL-35-MSCs通过c-Abl途径对CD4~+T细胞发挥增殖抑制和诱导Treg分化的功能。