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猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and Respiratory syndrome,PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and Respiratory syndrome virus,PRRSV)引起的猪群内一种高度接触性扩散传染病,该病在我国猪群中广泛流行,并常用其他病毒出现混合感染,严重威胁着我国养猪业。虽然目前有多种针对这种病原的检测方法,但是常规病原学、血清学检测方法由于其耗时、耗力等劣势。因此,建立一种省时、省力且自动化程度高的病原学检测方法具有重要意义。于20世纪90年代发展起来的荧光定量PCR是一种能够用来定量检测核酸分子的新型技术。作为一种非序列特异性荧光染料,SYBR Green-1广泛应用于荧光定量PCR中,该技术原理是通过在PCR反应体系中加入SYBR Green-1荧光染料,可在PCR过程中出现荧光强度的变化,进而实现对PCR过程的实时监控,在反应结束后,通过绘制标准曲线,清晰展示核酸分子在未知样品中的定量分析。由于SYBR Green-1荧光定量PCR检测方法与其他定量方法相比,具有操作简单、成本低廉等优点,目前,该技术已成功应用于生命科学研究的诸多领域。本研究拟建立一种能够对PRRSV进行快速诊断的SYBR Green-1实时荧光定量PCR技术。本研究首先根据GenBank登录的PRRSV N蛋白基因序列合成能进行特异性扩增的引物,其扩增片段长度为272bp,将该片段进行克隆到pMD18T载体上并测序。测定所获得的pMD18T-ORF7重组质粒浓度,计算其拷贝数。将其进行梯度稀释后作为标准品,建立SYBR Green-1实时荧光定量PCR检测方法,该PCR检测方法相关系数R2为0.99。特异性试验显示,对照组PRRSV、CSFV、JEV基因组cDNA及PCV2、PRV和PPV基因组DNA均无特异性扩增。该方法检测灵敏度为3.30×10~2拷贝数/μl。重复性试验表明,组间变异系数在0.76%-1.50%之间,组内变异系数在0.14%-0.69%之间。表明该方法具有较好的特异性、灵敏度及可重复性。在用该检测方法检测获得的PRRSV感染阳性样品中,挑选一份样品进行PRRSV分离。结果成功到一株PRRSV,将其命名为PRRSV-NM12株。基因序列分析发现,该病毒属于美洲型PRRSV,且属于JXA1衍生毒株。Nsp2氨基酸序列出现了典型的30aa不连续缺失。此外,本研究利用相对定量PCR检测方法对PRRSV感染引起的SSBP3、ZC3HAVI和Viperin干扰素刺激基因的转录水平变化进行了检测,发现PRRSV接种PAM后可下调SSBP3和ZC3HAVI mRNA转录水平。可显著提高Viperin mRNA的转录水平。综上所述,本研究为PRRSV检测及防控提供了一定的理论参考。