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背景miRNAs通过调控胰岛β细胞的分化,胰岛素的合成与分泌,胰岛素信号转导等途径参与调节葡萄糖的摄取和血糖的平衡,在2型糖尿病(T2DM)的发生、发展及并发症的出现中发挥重要作用。因此,鉴定新的miRNA分子并揭示其在2型糖尿病发病中的作用机制具有重要的价值。目的以2型糖尿病患者和健康人的外周血液为对象,研究miRNA-152分子在两组人群中的差异,分析其表达水平与糖尿病临床指标之间的相关性;利用生物信息学分析和细胞实验,筛选出可能受到miRNA-152直接调控的靶基因,构建含有靶基因序列的重组质粒,进一步验证miRNA-152对靶基因的调节作用,揭示miRNA-152在T2DM发生中的作用及其机制。方法1.鉴定miRNA-152水平与T2DM发生之间的关系a)采集年龄相仿的健康献血者和未经治疗、且无并发症的T2DM患者的空腹外周血,EDTA抗凝处理后置于-80℃保存备用。同时收集两组人群的血液临床生化检测数据及T2DM患者的病历资料。b)在血液RNA中加入外参基因,使用Trizol法提取血液总RNA,加A尾反应使miRNA修饰上Poly(A)尾,逆转录反应得到miRNA的cDNA。c)利用荧光定量PCR技术鉴定两组人群中miRNA-152表达水平的差异。利用miRNA-152正向引物和反向通用引物扩增miRNA-152分子,同时扩增外参基因作为对照,分析miRNA-152分子水平在两组人群中的表达差异。d)根据两组人群的临床血液生化数据,分析miRNA-152水平分别与空腹血糖水平、甘油三酯、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、个体肥胖指数等糖尿病指标之间的相关性。2.鉴定T2DM过程中miR-152可能直接调控的靶基因a)使用权威的miRNA靶基因预测软件:DIANA TOOLS、miRanda和TargetScan,筛选可能受到miRNA-152调控且与T2DM发生相关的潜在靶基因。b)在肝癌HepG2细胞中转染miRNA模拟物miRNA-152 mimic,同时转染NC-mimic作为阴性对照。荧光定量PCR检测miRNA-152在细胞中的表达水平,以U6作为内参基因。同时检测过表达miRNA-152后靶基因的表达情况,以actin作为内参基因。初步将表达水平下调明显的基因作为靶基因。c)分析靶基因mRNA的3’非翻译区域(3’UTR区域),确定其可能与miRNA-152结合的潜在区域。设计加入双酶切位点的引物,采用PCR方法扩增出编码靶基因3’UTR区域的部分DNA片段,双酶切后克隆入pmirGLO双荧光素酶报告基因载体;菌落PCR鉴定阳性克隆,测序确定载体是否构建成功。d)将空载体和重组载体分别与miRNA-152 mimic或NC-mimic在HepG2细胞中进行共转染,转染后24小时进行双荧光素酶基因报告实验,检测不同组细胞荧光素酶活性的变化情况,在细胞内确定miRNA-152对靶基因的直接调控作用。结果1.miRNA-152在正常和T2DM人群中的表达差异:荧光定量PCR结果显示miRNA-152分子在T2DM患者中呈异常高表达,升高达1.4倍左右。进一步分析显示,miRNA-152分子水平与两组人群的空腹血糖水平呈显著正相关,与高密度脂蛋白水平呈明显负相关,但与甘油三酯水平、低密度脂蛋白、总胆固醇水平及肥胖指数并无明显相关性。2.初步筛选miRNA-152的潜在靶基因:利用生物信息学分析,初步筛选出8个与T2DM发生相关且可能受到miRNA-152调控的潜在靶基因。3.过表达miRNA-152后对潜在靶基因的影响:在HepG2细胞中转染miRNA-152mimic后发现,miRNA-152在细胞中过量表达近百倍左右。miRNA-152水平升高后靶基因ADAM17、CSF1和MET的表达水平均发生下调。4.靶基因重组载体的构建:进一步的生物信息学分析显示,CSF1和MET两个基因mRNA的3’UTR区域都含有多个与miRNA-152种子区潜在结合的位点。利用分子克隆的方法,将编码这两个基因3’UTR区域的DNA片段克隆入pmirGLO载体,测序结果显示两个重组质粒均构建成功。5.双荧光素酶报告基因实验确定miRNA-152对靶基因的直接调控作用:共转染后的双荧光素酶报告基因实验显示,CSF1和MET的重组载体分别与miRNA-152转染后均能够检测到荧光素酶活性的明显下降,说明miRNA-152直接参与了CSF1和MET基因表达的调控。结论1.分析健康人群和T2DM人群的临床样本后发现,miRNA-152在T2DM患者的血液中呈异常高表达,且miRNA-152分子水平与两组人群的空腹血糖水平呈显著正相关,与高密度脂蛋白水平呈明显负相关。2.初步确定CSF1和MET可能是miRNA-152直接作用的靶基因,提示过量表达的miRNA-152可能通过抑制这些基因的表达参与T2DM的发生。