子宫颈部位输卵管蛋白表达和功能的初步研究及其在毕赤酵母的重组表达及纯化

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本实验室自克隆了兔输卵管糖蛋白(DPF一1)全长cDNA,并通过“功能缺失”实验表明它具有克服早胚发育阻断的功能。为了对DPF一1的功能进行更全面的研究,搞清楚DPF一1的确切生物学功能,本实验室用RT-PCR方法从小鼠子宫颈扩增到了405bp小鼠输卵管糖蛋白的氨基端部分序列,并进行了下列实验: 用半定量RT-PCR法证明,子宫颈输卵管糖蛋白mRNA的水平与小鼠动情期有关。又初步研究兔输卵管上皮细胞条件培液对人精子活力的影响,发现兔输卵管上皮细胞条件培液对人精子活力无影响。 通过构建了pPIC9K/DPF—lcDNA重组表达载体,并用BglII线性化pPIC9K/DPF一1,电转化毕赤酵母GSll5,筛选到高拷贝转化子。慢型(Muts)重组子在毕赤酵母pPIC9表达系统中得到了表达分泌产物的重组DPF一1。进一步通过离子交换层析和凝胶过滤层析进行纯化,达到电泳纯。 为了明确早胚发育机制,用酵母双杂交筛选卵母细胞中与输卵管蛋白相互作用的靶分子成分为目的,构建小鼠卵母细胞cDNA酵母双杂交文库。文库的滴度为3.4X106,重组片段大小主要集中lkb左右,重组率为60%。构建了pGBKT7/DPF一1cDNAl.3kbDPF一1cDNA片段和0.27kbDPF一1cDNA重组表达载体,作为酵母双杂交诱饵质粒。营养缺陷型筛选及Filter实验显示ADE及HIS报告基因未活化,LACZ报告基因轻度活化。提示两种诱饵质粒没有明显自激活现象,可以用来进行酵母双杂交实验。这些都为今后的研究工作打下了基础。
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