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MicroRNAs(miRNAs)是存在于生物体内22个核苷酸左右的重要短基因片段。其在脂类代谢中也是重要的调控因子,而脂类是牛奶的主要成分,对幼畜的成长和发育有着至关重要的作用。所以,筛选出来这些影响乳脂代谢和乳腺上皮细胞活力的miRNAs成为研究人员重要的研究工作之一。miR-29b作为众多关键miRNAs中的一员,参与许多重要的生命过程,包括癌细胞的增殖迁移和肠上皮细胞的增殖等。另外,经对高脂奶牛和低脂奶牛乳腺组织分析发现,mi R-29b的表达量在两者间存在着显著的差异表达,表明miR-29b可能是调控脂质代谢是关键因子。miR-29b通过调控靶基因参与乳脂代谢和细胞凋亡过程,所以本研究首先通过生物信息学分析预测并且分析了与miR-29b有关的潜在靶基因,结果显示,mi R-29b可以识别4353个转录子中5730个结合位点。经功能分析,我们初步锁定LPL和TDG基因作为本研究的靶基因。LPL-3’-UTR(1802-1809 bp)和TDG-3’-UTR(1057-1064 bp)分别存在能与miR-29b成熟序列所包含的种子序列(AGCACCA)特异性识别的位点。然后根据结合位点我们分别设计了包含LPL-3’-UTR-WT(UGGUGCUA),LPL-3’-UTR-mut(CAAGUACG),TDG-3’-UTR-WT(UGGUGCUA),TDG-3’-UTR-mut(CAAGUACG)的载体。双荧光素酶报告系统检测发现,与参照组比较,miR-29b mimics和TDG-3’-UTR-WT共转染组荧光素酶活性显著低于对照组(p<0.05),而和TDG-3’-UTR-mut共转染组与对照组之间无显著差异(p>0.05);miR-29b mimics和LPL-3’-UTR-WT共转染组荧光素酶活性显著低于对照组(p<0.05),其和LPL-3’-UTR-mut共转染组与对照组之间也无显著差异(p>0.05),进一步验证了TDG和LPL是miR-29b的潜在靶基因。为详细了解miR-29b是如何在细胞中发挥调控作用的,我们将合成的mi R-29b过表达载体(miR-29b mimics)、miR-29b抑制剂(miR-29b inhibitor)和阳性对照(miR-shNC)转染到乳腺上皮细胞中。荧光显微镜下观察到的绿色荧光表明载体成功转染到细胞中,并且经荧光定量检测说明miR-29b成功在乳腺上皮中过表达和干扰。实时荧光定量检测结果显示miR-29b mimics组的TDG和LPL mRNA的表达量显著降低(p<0.01);随后进行的蛋白免疫印迹检测结果显示,TDG和LPL基因表达蛋白在miR-29b inhibitor组显著高表达,而在mi R-29b mimics组显著被下调,综合以上实验结果说明miR-29b可通过降解靶基因的mRNA或抑制靶基因的蛋白翻译这两种方式发挥其作用。随后,我们在乳腺上皮细胞中成功的过表达和干扰mi R-29b,探究mi R-29b对乳脂代谢和细胞凋亡的影响。经流式细胞仪检测发现,细胞凋亡率分别为mi R-29b mimics组(8.78%)、mi R-29b inhibitor组(21.86%)和miR-shNC组(17.1%),表明过表达miR-29b会抑制乳腺上皮细胞的凋亡。与此同时,沉默mi R-29b会促进乳腺上皮细胞的凋亡。在接下来的实验中,我们在乳腺上皮细胞中分别转染了miR-29b mimics、miR-29b inhibitor和miR-shNC,培养24 h后,检测了细胞内部甘油三酯的表达量。结果显示过表达miR-29b会显著促进甘油三酯的生成,但是干扰miR-29b却对甘油三酯的影响不明显,说明可能只有在mi R-29b表达量相对较高时对甘油三酯的形成才有影响。结合以上实验结果,我们推测miR-29b可能通过下调靶基因TDG和LPL实现其抑制乳腺上皮细胞凋亡和促进甘油三酯含量增多,为乳脂代谢过程提供基本的理论依据和分子机制分析。