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背景:在血液系统恶性肿瘤中,B细胞恶性肿瘤的发病率逐年攀升,然而B细胞恶性血液肿瘤的治疗手段仍十分有限。尽管目前CD19 CAR-T在治疗CD19阳性的B细胞恶性血液肿瘤中己取得了巨大进步,但是经传统CD19CAR-T治疗后仍具有较高的复发率。因此,制备一种新型CAR-T抗B细胞恶性肿瘤是当前亟需解决的问题。目的:本研究利用课题组前期筛选的CD19纳米抗体,构建基于纳米抗体的 CD19 CAR-T 细胞(CD19/NB CAR-T),探索 CD19/NB CAR-T 细胞体外增殖活性及对靶细胞的杀伤作用,进一步研究CD19/NB CAR-T细胞在体内对NOD/SCID鼠荷Nalm6细胞血液瘤的生长抑制作用,为纳米抗体用于恶性血液肿瘤的过继免疫细胞治疗提供新的策略。方法:1.分离培养人外周血T淋巴细胞,用CD19/NB CAR慢病毒转染T细胞获得CD19/NB CAR-T细胞;荧光显微镜观察CD19/NB CAR-T细胞中GFP的表达;通过流式细胞术检测CD19/NB CAR-T细胞表达GFP的情况和 CD19/NB CAR-T 细胞中 CD4+/CD8+比例。2.通过流式细胞术检测CD19/NB CAR-T细胞与靶细胞共同孵育后的增殖情况;通过流式细胞术检测CD19/NB CAR-T细胞与靶细胞共同孵育后CD19/NB CAR-T细胞表面活化分子CD25、CD69,记忆分子CD62L,溶酶体蛋白CD107a的表达情况。3.通过流式细胞术检测Nalm6、Raji、K562-CD19、K562细胞表面CD19表达情况;采用流式细胞术检测CD19/NB CAR-T细胞对Nalm6、Raji、K562-CD19、K562细胞的杀伤作用。4.采用ELISA检测CD19/NB CAR-T细胞经靶细胞刺激后分泌细胞因子(TNF-α、IL-2、IL-10)的情况,ELISPOT 检测 CD19/NBCAR-T 细胞经靶细胞刺激后分泌IFN-γ的T细胞数量。5.构建NOD/SCID鼠荷Nalm6细胞血液瘤模型,随机分为PBS、UTD、Mock、CD105/NB CAR和CD19/NB CAR组。经尾静脉分别注射各组CAR T细胞后,检测荷瘤小鼠血液中恶性肿瘤细胞残余数,观察小鼠的生存率等指标探索CD19/NB CAR-T细胞在体内的抗肿瘤作用。结果:1.将慢病毒转染T细胞后,荧光显微镜下观察到GFP荧光,经流式细胞术检测结果显示Mock组、CD105/NB CAR组和CD19/NB CAR组的T细胞GFP表达率均超过40%,分别达到(40.5 ± 2.37)%、(42.2±3.09)%和(41.7± 2.86)%,表明 CD19/NB CAR-T 细胞制备成功。2.CD19/NB CAR-T细胞经CD19+靶细胞刺激后增殖明显高于其余对照组别(P<0.001);CD19/NB CAR-T细胞表面活化分子CD25、CD69,记忆分子CD62L和溶酶体蛋白CD107a的表达水平高于其余对照组(P<0.001)。3.经流式细胞术检测显示K562-CD19、Nalm6、Raji细胞的CD19表达率分别达到90.1%、77.3%、69.5%,K562细胞几乎不表达CD19。CD19/NB CAR-T细胞可在体外特异杀伤CD19+的靶细胞。4.CD19/NB CAR-T 细胞经 CD19+靶细胞(K562-CD19 细胞、Nalm6 细胞)刺激后分泌细胞因子TNF-α和IL-2的含量明显高于其余对照组,各组中IL-10的含量相比较无统计学差异;CD19/NB CAR-T细胞经CD19阴性靶细胞(K562细胞)刺激后分泌细胞因子TNF-α、IL-2及IL-10的含量与其余对照组比较无统计学差异。ELISPOT检测结果显示CD19/NB CAR-T细胞经CD19+靶细胞(Nalm6细胞)刺激后分泌IFN-γ的T细胞数量明显高于其余对照组。5.体内实验结果显示,经CD19/NB CAR-T细胞治疗荷Nalm6 NOD/SICD小鼠后,CD19/NB CAR-T细胞对表达CD19的血液瘤有一定的治疗效果,荷瘤小鼠肿瘤细胞生长受到一定的抑制,生存曲线结果图显示经CD19/NB CAR-T细胞治疗后荷瘤小鼠的生存时间延长。结论:该研究成功构建基于纳米抗体的CD19CAR-T细胞,CD19/NB CAR-T细胞可在体外特异性靶向杀伤CD19+靶细胞,在荷Nalm6细胞NOD/SCID小鼠体内具有抗肿瘤效应,为纳米抗体用于恶性血液肿瘤的过继免疫治疗提供了新的策略。